多光譜成像系統(tǒng)和方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求享有于2013年1月10日提交的第61/751，194號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng) 的優(yōu)先權(quán)，通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開(kāi)涉及對(duì)生物學(xué)樣本進(jìn)行成像，并且更具體地涉及對(duì)細(xì)胞和組織進(jìn)行多光譜 明視場(chǎng)成像以及圖像分析。
【背景技術(shù)】
[0004] 生物學(xué)細(xì)胞和組織樣本的色彩圖像對(duì)于包括診斷、通信、歸檔和分析的使用是有 價(jià)值的。一種常用的成像技術(shù)是產(chǎn)生所謂的明視場(chǎng)圖像，其中通過(guò)透射通過(guò)樣本的光或者 從樣本反射的光形成圖像。明視場(chǎng)影像對(duì)于通過(guò)蘇木素伊紅（Hematoxylin and Eosin)、巴 氏涂片（Papanicolau)染色劑、諸如DAB這樣的免疫組化染色劑以及其他有吸收性和擴(kuò)散 性的試劑制備的樣本是有用的。在這樣的情況下的圖像對(duì)應(yīng)于樣本的RGB(色彩）視圖，并 且可以使用數(shù)字色彩（RGB)相機(jī)來(lái)記錄。
[0005] 數(shù)字RGB相機(jī)采用多種技術(shù)來(lái)獲得圖像。最常用的是將諸如Bayer圖案這樣的彩 色馬賽克圖案合并到像素化傳感器中，使得各個(gè)像素以特定色彩記錄信號(hào)內(nèi)容，并且組合 來(lái)自相鄰像素的信號(hào)以創(chuàng)建對(duì)像素鄰域中的色彩內(nèi)容的估計(jì)。替代地，在三芯片彩色相機(jī) 中，使用三色光學(xué)元件對(duì)進(jìn)入的光根據(jù)其色彩進(jìn)行分離，并且將不同色彩的光指引到三個(gè) 不同的成像傳感器上，因此，每個(gè)傳感器接收給定主色彩的光。然后組合來(lái)自三個(gè)傳感器的 圖像以形成總體色彩圖像。
[0006] 在其他RGB相機(jī)中，與單色傳感器一起采用色彩濾波輪或電子可調(diào)諧濾波器，并 且在濾波器在主色彩之間循環(huán)的同時(shí)取得三個(gè)或更多的圖像。組合各個(gè)色彩平面的結(jié)果圖 像以形成色彩圖像。
[0007] 通過(guò)不同的技術(shù)，彩色相機(jī)產(chǎn)生具有與每個(gè)主色彩中的總體信號(hào)相對(duì)應(yīng)的R、G和 B值的圖像，或者等效地，圖像可以表示在諸如L*ab、Luv、YIQ、XYZ等其他色彩空間中。
[0008] 已經(jīng)開(kāi)發(fā)出可以產(chǎn)生整個(gè)顯微鏡載玻片或其部分的數(shù)字明視場(chǎng)圖像的全視野載 玻片成像系統(tǒng)。它們包括顯微鏡成像光學(xué)元件（optics)和數(shù)字相機(jī)以及機(jī)械裝置以清掃 對(duì)樣本的掃描，還包括軟件以協(xié)調(diào)這些動(dòng)作并且存儲(chǔ)結(jié)果圖像。典型的病理學(xué)樣品可以在 5分鐘或更少內(nèi)成像，往往在2分鐘或更少，并且結(jié)果圖像可以具有1/4微米或更精細(xì)的分 辨率，其對(duì)應(yīng)于15x15mm樣本的36億個(gè)像素。這些系統(tǒng)用在研究和臨床病理學(xué)領(lǐng)域，以對(duì) 組織切片、細(xì)胞學(xué)樣本以及進(jìn)行顯微鏡成像是有價(jià)值的其他樣本進(jìn)行成像。
[0009] 全視野載玻片明視場(chǎng)成像的一個(gè)應(yīng)用是對(duì)免疫組化（IHC)化驗(yàn)的測(cè)量和定量。這 些是基于抗體的化驗(yàn)，通常使用酶促放大步驟，其中將色原體綁定到包含特定蛋白質(zhì)的位 點(diǎn)，使得能夠檢測(cè)和測(cè)量蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0010] 存在能夠測(cè)量樣本的明視場(chǎng)圖像中的多于3個(gè)色彩的多光譜成像系統(tǒng)。Vectra成 像系統(tǒng)（可以從PerkinElmer, Waltham MA得到）是這樣的系統(tǒng)的示例。其使用液晶可調(diào) 諧濾波器在計(jì)算機(jī)控制下選擇可見(jiàn)范圍內(nèi)的各個(gè)波長(zhǎng)，同時(shí)用單色數(shù)字相機(jī)取得圖像。這 樣獲取的數(shù)據(jù)被稱為圖像棧或圖像立方體，并且包含圖像中的很多空間位置中的每一處的 光譜。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0011] 一般地，在第一方面中，本公開(kāi)涉及的方法的特征在于包括：獲得樣本的第一圖 像，其中第一圖像對(duì)應(yīng)于以第一多個(gè)有區(qū)別的光譜帶透射通過(guò)樣本的光；獲得樣本的第二 圖像，其中第二圖像對(duì)應(yīng)于以第二多個(gè)有區(qū)別的光譜帶透射通過(guò)樣本的光，并且第二多個(gè) 光譜帶中的至少一些成員與第一多個(gè)光譜帶中的成員不同；以及使用電子處理器組合第一 和第二圖像以形成多光譜圖像棧，其中圖像棧中的每個(gè)像素包括對(duì)應(yīng)于至少四個(gè)有區(qū)別的 光譜帶的信息，并且其中至少四個(gè)有區(qū)別的光譜帶包括來(lái)自第一多個(gè)光譜帶的至少一個(gè)成 員以及來(lái)自第二多個(gè)光譜帶的至少一個(gè)成員。
[0012] 所述方法的實(shí)施例可以包括以下特征中的任何一個(gè)或多個(gè)。
[0013] 圖像棧中的每個(gè)像素可以包括對(duì)應(yīng)于至少五個(gè)有區(qū)別的光譜帶的信息。圖像棧中 的每個(gè)像素可以包括對(duì)應(yīng)于至少六個(gè)有區(qū)別的光譜帶的信息。
[0014] 第一多個(gè)有區(qū)別的光譜帶可以包括具有一半最大值為40nm或以下（例如，30nm或 以下）的完全寬度的電磁光譜的綠色區(qū)域中的光譜帶。
[0015] 所述方法可以包括使用電子處理器對(duì)圖像棧去混合（unmix)以獲得一個(gè) 或多個(gè)成分圖像，其中每個(gè)成分圖像僅充分地對(duì)應(yīng)于來(lái)自樣本中的一個(gè)光譜貢獻(xiàn)者 (contributor)的貢獻(xiàn)。所述方法可以包括使用電子處理器在對(duì)圖像棧去混合之前將對(duì)應(yīng) 于圖像棧中的每個(gè)像素的光強(qiáng)值轉(zhuǎn)換為光強(qiáng)單位。所述方法可以包括使用電子處理器以基 于一個(gè)或多個(gè)成分圖像來(lái)分析樣本以確定樣本內(nèi)的特征的位置。
[0016] 所述方法可以包括使用載玻片掃描器來(lái)獲得第一和第二圖像。第一多個(gè)光譜帶和 第二多個(gè)光譜帶的每個(gè)可以包括共享光譜帶，所述方法可以包括使用電子處理器在形成圖 像棧之前基于來(lái)自對(duì)應(yīng)于共享光譜帶的第一和第二圖像的信息來(lái)對(duì)齊第一和第二圖像。
[0017] 所述方法的實(shí)施例還可以適當(dāng)?shù)匾匀魏谓M合的形式包括在本文中公開(kāi)的任何其 他特征和/或方面和/或步驟。
[0018] 在另一方面中，本公開(kāi)涉及的系統(tǒng)的特征在于包括被配置為照明樣本的光源、被 配置為獲得樣本的一個(gè)或多個(gè)圖像的檢測(cè)器以及電子處理器，所述電子處理器耦接到檢測(cè) 器并且被配置為：獲得樣本的第一圖像，其中第一圖像對(duì)應(yīng)于以第一多個(gè)有區(qū)別的光譜帶 透射通過(guò)樣本的光；獲得樣本的第二圖像，其中第二圖像對(duì)應(yīng)于以第二多個(gè)有區(qū)別的光譜 帶透射通過(guò)樣本的光，并且其中第二多個(gè)光譜帶中的至少一些成員與第一多個(gè)光譜帶中的 成員不同；以及組合第一和第二圖像以形成多光譜圖像棧，其中圖像棧中的每個(gè)像素包括 對(duì)應(yīng)于至少四個(gè)有區(qū)別的光譜帶的信息，并且其中至少四個(gè)有區(qū)別的光譜帶包括來(lái)自第一 多個(gè)光譜帶的至少一個(gè)成員以及來(lái)自第二多個(gè)光譜帶的至少一個(gè)成員。
[0019] 所述系統(tǒng)的實(shí)施例可以包括以下特征中的任何一個(gè)或多個(gè)。
[0020] 圖像棧中的每個(gè)像素可以包括對(duì)應(yīng)于至少五個(gè)有區(qū)別的光譜帶的信息。圖像棧中 的每個(gè)像素可以包括對(duì)應(yīng)于至少六個(gè)有區(qū)別的光譜帶的信息。
[0021] 第一多個(gè)有區(qū)別的光譜帶可以包括具有一半最大值為40nm或以下（例如，30nm或 以下）的完全寬度的電磁光譜的綠色區(qū)域中的光譜帶。
[0022] 電子處理器可以被配置為對(duì)圖像棧去混合以獲得一個(gè)或多個(gè)成分圖像，其中每個(gè) 成分圖像僅充分地對(duì)應(yīng)于來(lái)自樣本中的一個(gè)光譜貢獻(xiàn)者的貢獻(xiàn)。電子處理器可以被配置為 在對(duì)圖像棧去混合之前將對(duì)應(yīng)于圖像棧中的每個(gè)像素的光強(qiáng)值轉(zhuǎn)換為光強(qiáng)單位。電子處理 器可以被配置為基于一個(gè)或多個(gè)成分圖像來(lái)分析樣本以確定樣本內(nèi)的特征的位置。
[0023] 所述系統(tǒng)可以包括以光源和檢測(cè)器為特征的載玻片掃描器。第一多個(gè)光譜帶和第 二多個(gè)光譜帶的每個(gè)可以包括共享光譜帶，并且電子處理器可以被配置為在形成圖像棧之 前基于來(lái)自對(duì)應(yīng)于共享光譜帶的第一和第二圖像的信息來(lái)對(duì)齊第一和第二圖像。
[0024] 所述系統(tǒng)的實(shí)施例還可以適當(dāng)?shù)匾匀魏谓M合的形式包括在本文中公開(kāi)的任何其 他特征和/或方面和/或組件。
[0025] 在另一個(gè)方面中，本公開(kāi)涉及的方法的特征在于包括：(a)使用彩色相機(jī)來(lái)獲得 樣本的第一圖像，其中（i)第一圖像包括多個(gè)像素，每個(gè)像素以三個(gè)光強(qiáng)信號(hào)為特征，（ii) 對(duì)于每個(gè)像素，每個(gè)光強(qiáng)信號(hào)對(duì)應(yīng)于入射到樣本上的三個(gè)有區(qū)別的波長(zhǎng)帶中的一個(gè)或多個(gè) 中的照明光，并且（iii) 一個(gè)波長(zhǎng)帶對(duì)應(yīng)于電磁光譜的綠色區(qū)域，并且具有一半最大值為 40nm或以下的完全寬度；以及（b)使用電子處理器來(lái)（i)變換第一圖像以生成校正圖像， 其中變換包括針對(duì)每一個(gè)像素調(diào)整三個(gè)光強(qiáng)信號(hào)中的每個(gè)以減小來(lái)自三個(gè)有區(qū)別的波長(zhǎng) 帶之一以外的全部中的照明光的對(duì)其的貢獻(xiàn)，以及（ii)將校正圖像中的光強(qiáng)值變換成光 強(qiáng)單位。
[0026] 所述方法的實(shí)施例可以包括以下特征中的任何一個(gè)或多個(gè)。
[0027] 所述方法可以包括使用電子處理器對(duì)校正圖像去混合以獲得一個(gè)或多個(gè)成分圖 像。所述方法可以包括使用電子處理器來(lái)基于一個(gè)或多個(gè)成分圖像分析樣本以確定樣本內(nèi) 的特征的位置。
[0028] 所述方法的實(shí)施例還可以適當(dāng)?shù)匾匀魏谓M合的形式包括在本文中公開(kāi)的任何其 他特征和/或方面和/或步驟。
[0029] 在另一方面中，本公開(kāi)涉及的方法的特征在于包括：(a)使用彩色相機(jī)來(lái)獲得樣 本的第一圖像，其中（i)第一圖像包括多個(gè)像素，每個(gè)像素以三個(gè)光強(qiáng)信號(hào)為特征，（ii) 對(duì)于每個(gè)像素，每個(gè)光強(qiáng)信號(hào)對(duì)應(yīng)于三個(gè)有區(qū)別的波長(zhǎng)帶中的一個(gè)或多個(gè)中的樣本發(fā)送的 光，并且（iii) 一個(gè)波長(zhǎng)帶對(duì)應(yīng)于電磁光譜的綠色區(qū)域，并且具有一半最大值為40nm或以 下的完全寬度；以及（b)使用電子處理器來(lái)（i)變換第一圖像以生成校正圖像，其中變換包 括針對(duì)每一個(gè)像素調(diào)整三個(gè)光強(qiáng)信號(hào)中的每個(gè)以減小來(lái)自三個(gè)有區(qū)別的波長(zhǎng)帶之一以外 的全部中的樣本發(fā)射的光的對(duì)其的貢獻(xiàn)，以及（ii)將校正圖像中的光強(qiáng)值變換成光強(qiáng)單 位。
[0030] 所述方法的實(shí)施例可以包括以下特征中的任何一個(gè)或多個(gè)。
[0031] 所述方法可以包括使用電子處理器對(duì)校正圖像去混合以獲得一個(gè)或多個(gè)成分圖 像。所述方法可以包括使用電子處理器來(lái)基于一個(gè)或多個(gè)成分圖像分析樣本以確定樣本內(nèi) 的特征的位置。
[0032] 所述方法的實(shí)施例還可以適當(dāng)?shù)匾匀魏谓M合的形式包括在本文中公開(kāi)的任何其 他特征和/或方面和/或步驟。
[0033] 除非以其他方式定義，在本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本公開(kāi)所屬的技 術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的具有相同含義。盡管與在本文中所公開(kāi)的方法和材 料類似或等同的方法和材料可以用在本文的主題的實(shí)踐或測(cè)試中，在下面描述適合的方法 和材料。通過(guò)引用將所有公開(kāi)、專利申請(qǐng)、專利以及在本文中提及的其他參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi) 容并入本文。在沖突的情況下，本說(shuō)明書(shū)（包括定義）將進(jìn)行控制。另外，材料、方法和示 例僅是示例性的，而不用于進(jìn)行限制。
[0034] 下面將結(jié)合附圖和描述來(lái)闡述一個(gè)或