一種雞傳染性支氣管炎間接elisa抗體檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種雞傳染性支氣管炎間接ELISA抗體檢測試劑盒，屬于生物技術領 域。
【背景技術】
[0002] 雞傳染性支氣管炎（Infectious Bronchitis，IB)是由傳染性支氣管炎病毒 (IBV)引起雞的一種急性、高度接觸傳染性呼吸道傳染病，本病呈世界性分布，是嚴重危害 養禽業的最主要疫病之一。疫苗免疫是預防和控制雞傳染性支氣管炎發生的最有效途徑， 而免疫后抗體水平的高低反映實際的疫苗免疫效果，直接關系到免疫雞群對雞傳染性支氣 管炎病毒的抵抗力。雞傳染性支氣管炎疫苗免疫雞后血清中的病毒抗體可通過酶聯免疫 的方法檢測，酶聯免疫吸附試驗系統經證實在IBV抗體水平的定量檢測上是有效的，有利 于檢測大規模群體的免疫狀況。血清中的IBV抗體（主要包括IgG)水平及整個雞群的免 疫狀況可用ELISA方法進行檢測。該方法是將抗原包被在微孔板上，加入稀釋后的血清并 孵育，血清中的抗IBV抗體將與包被在微孔板上的IBV結合，形成IBV抗原-抗體復合物， 洗掉未結合的物質，加入過氧化物酶或者堿性磷酸酶標記的抗雞IgG的酶標結合物至微孔 板中，酶標物將與IBV抗原-抗體復合物結合，孵育后洗掉未結合的酶標物，然后加入底物 溶液，底物與堿性磷酸酶進一步發生反應并生成一種帶有藍色或黃色等顏色的產物，最后 通過加入終止液終止酶活性反應，將顏色固定，顏色的深淺可用酶標儀（405-410nm或者 630-650nm)測定，測定值的大小反應抗體水平的高低，還可通過一定的計算方法來界定血 清中抗體的轉化情況?？梢?，抗體間接ELISA檢測方法是傳染性支氣管炎抗體水平定量檢 測的有效方法，具有重要的應用價值。
[0003] IBV的核蛋白作為一種主要結構蛋白，具有高度保守性，不同血清型間同源性高 達94%~99%。并且有高度免疫原性，能誘導產生抗體。所以，核蛋白是IBV群特異性血 清學檢測診斷抗原的最佳選擇。Ndifuna等人以及杜恩岐等人用大腸桿菌原核系統體外表 達IBV的全長核蛋白，表明其具有免疫原性，郝春麗等應用原核系統體外表達IBV的全長核 蛋白作為抗原建立了 NP-ELISA抗體檢測方法，可用于的診斷。然而，基于原核系統表達的 IBV核蛋白N-末端部分抗原性更加特異，將該特異蛋白用于抗原開展抗體檢測的研究和應 用均未見報道。
【發明內容】
[0004] 為解決上述問題，本發明提供了一種基于原核系統表達的雞傳染性支氣管炎間接 ELISA抗體檢測試劑盒，所采取的技術方案如下：
[0005] 本發明的目的在于提供一種雞傳染性支氣管炎間接ELISA抗體檢測試劑盒，該試 劑盒含有經過純化的雞傳染性支氣管炎病毒核蛋白N-末端160個氨基酸的部分核蛋白的 酶標板，其中雞傳染性支氣管炎病毒核蛋白編碼基因的GeneBank登錄號為AY839143. 1。
[0006] 優選地，所述雞傳染性支氣管炎病毒，為雞傳染性支氣管炎病毒毒株ck/CH/ LJL04L·
[0007] 優選地，所述N-末端160個氨基酸的重組蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 優選地，所述N-末端160個氨基酸的重組蛋白的制備方法步驟如下：
[0009] 1)通過RT-PCR從傳染性支氣管炎病毒ck/CH/LJL04I擴增獲得核蛋白基因 N-端 編碼160個氨基酸的N160基因；
[0010] 2)將步驟1)所得基因整合到質粒載體中，獲得重組質粒；
[0011] 3)將步驟2)所構建的重組質粒轉化到宿主菌中并誘導表達，獲得菌液；
[0012] 4)分離并利用親和層析技術純化步驟3)所得菌液，獲得重組N160蛋白。
[0013] 優選地，步驟1)所述擴增，所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 4 所示。
[0014] 優選地，步驟2)所述質粒載體，是質粒pGEX_6P_l。
[0015] 優選地，所述酶標板的制備方法如下：
[0016] 1)向酶標板的每孔中分別加入含量為5 μ g純化的雞傳染性支氣管炎病毒部分核 蛋白N16。的抗原溶液，4°C包被過夜；
[0017] 2)利用洗滌液洗滌3_5遍；
[0018] 3)再用250 μ L1-5%牛血清白蛋白溶液封閉，洗滌。
[0019] 優選地，所述試劑盒還包括：
[0020] (1) 10 X PBST 濃縮洗滌液：pHL 4,體積 2OOmL ;
[0021] (2) 10 X 血清稀釋液：ρΗ7· 4,體積 200mL ;
[0022] (3)酶標試劑：辣根過氧化物酶標記的兔抗雞或羊抗雞抗體，25mL ;
[0023] (4)底物顯色液：60mL ;
[0024] (5)終止液：60mL ;
[0025] (6)標準陽性對照：5mL ;
[0026] (7)標準陰性對照：0· 5mL。
[0027] 優選地，所述PBST濃縮洗滌液為1-5% Tween_20、8%氯化鈉、0. 2%氯化鉀、3%磷 酸氫二鈉和〇. 2%磷酸二氫鉀的水溶液；所述IOX血清稀釋液為上述10XPBST濃縮洗滌 液加入1-5 %牛血清白蛋白的溶液；所述底物顯色液為TMB單組份底物顯色液，其主要成分 為10mg/mL的3, 3'，5, 5' -四甲基聯苯胺磷酸緩沖溶液，而磷酸緩沖液為：0. lmol/L磷酸二 氫鈉水溶液87. 7mL和0. lmol/L磷酸氫二鈉水溶液12. 3mL混合而成的液體。
[0028] 優選地，所述標準陽性對照，為利用所述酶標板標定為OD63。或OD 65。吸光值在 0. 1-0. 8之間的傳染性支氣管炎抗體陽性血清稀釋液；所述標準陰性對照，為利用所述酶 標板標定為OD63。或OD 65。吸光值在0. 03-0. 1之間的傳染性支氣管炎抗體陰性血清稀釋液。
[0029] 本發明構建的傳染性支氣管炎抗體檢測試劑盒應用于檢測傳染性支氣管炎疫苗 免疫雞或者雞感染傳染性支氣管炎后誘導產生的傳染性支氣管炎病毒特異性抗體。
[0030] 發明人對不同長度N-端蛋白的蛋白敏感度、特異性及符合率等進行了測定，發現 并不是任意長度的N-端蛋白均能取得良好效果，其中N140, N160和N180的效果較佳。經 過大量研究發現，重組N160蛋白的綜合效果要優于N140蛋白和N180蛋白。
[0031] 本發明獲得有益效果如下：
[0032] 本發明利用能夠穩定表達重組雞傳染性支氣管炎病毒部分核蛋白（N-末端160個 氨基酸，簡稱N160)的基因工程菌，在合適的條件下誘導表達重組N160蛋白并經親和層析 純化。用純化出的重組N160蛋白作為包被抗原，建立一種簡便、特異的間接ELISA方法。
[0033] 本發明還為檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體提供了特異、敏感、快速、操作簡便的 試劑盒，能夠在實際生產中快速診斷雞群是否感染雞傳染性支氣管炎病毒、監測免疫雞血 清抗體水平及雛雞母源抗體水平，以評估雞群感染傳染性支氣管炎病毒的風險程度，為傳 染性支氣管炎免疫程序的制定提供參考。
【附圖說明】
[0034] 圖1為37°C、0. 5mmol/L IPTG誘導條件下Nl-GST融合蛋白的表達分析；
[0035] (M :蛋白質標準分子量；1 :未誘導陽性菌；2 :誘導2h后菌體上清；3 :誘導2h后菌 體沉淀；4 ;誘導4h后菌體上清；5 :誘導4h后菌體沉淀；6 :誘導6h后菌體上清；7 :誘導6h 后菌體沉淀）。
[0036] 圖2為37°C、0. 5mmol/L IPTG誘導條件下N2-GST融合蛋白的表達分析；
[0037] (M :蛋白質標準分子量；1 :未誘導陽性菌；2 :誘導2h后菌體上清；3 :誘導2h后菌 體沉淀；4 :誘導4h后菌體上清；5 :誘導4h后菌體沉淀；6 :誘導6h后菌體上清；7 :誘導6h 后菌體沉淀；8 :誘導8h后菌體上清；9 :誘導8h后菌體沉淀）。
[0038] 圖3為37°C、0. 5mmol/L IPTG誘導條件下N-GST融合蛋白的表達分析；
[0039] (M :蛋白質標準分子量；1 :未誘導陽性菌；2 :誘導2h后菌體上清；3 :誘導2h后菌 體沉淀；4 :誘導