一種識別天冬氨酸光學異構體的電化學方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及電化學分析測試技術領域，具體涉及一種利用溶膠凝膠法和分子印跡技術相結合，識別天冬氨酸光學異構體的電化學方法。
【背景技術】
[0002]隨著科學研究的進步，醫藥、農藥，飼料和香料等領域對光學異構體的認識也在不斷加深，其原因在于光學異構體之間通常顯示著不同的生理活性，比如說谷氨酸，L體有鮮味，也就是人們在日常生活中所用的味素，而D體人的舌頭是感覺不到鮮味，而是感覺到發酸。目前對氨基酸光學異構體的識別及檢出的研究主要采用色譜法和修飾電極法。氣相色譜對氨基酸光學異構體的分離主要是基于兩種方式，一種是將待分析的氨基酸與光學活性的試劑反應后，通過色譜柱進行分離檢測，另一種是用光學活性的手性固定相進行直接的分離檢測的方法。
[0003]目前，采用分子印跡技術應用于電化學傳感器的檢測已有報道，逐漸引起人們關注。采用高分子作為鑄型分子時，有其自身的弱點，如受溶劑的浸泡，會導致鑄型分子的溶脹，在修飾電極方面，會造成鑄型分子與基底電極的附著強度降低，更甚者鑄型高分子膜會從電極上脫落，待識別分子在高分子膜中的擴散較慢，也影響了其選擇性和應答速度。另夕卜，眾多的氨基酸均沒有電化學活性，很難通過電化學的方式進行檢測。
【發明內容】
[0004]為解決上述問題，本發明通過構筑對天冬氨酸光學異構體具有選擇性的S12為鑄型膜，實現S12薄膜對氨基酸光學異構體的選擇性識別。溶膠凝膠法是一種制備無機薄膜的優異技術，構筑印跡氨基酸光學異構體三元絡合物的3丨02薄膜修飾電極，由于三元絡合物中銅離子的引入，通過對銅離子還原電流的檢測，達到該修飾電極可選擇性檢測識別無電化學活性的氨基酸光學異構體。
[0005]本發明通過溶膠-凝膠的方法，制備印跡L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp三元絡合物的S12薄膜的修飾電極。在制備溶膠時，加入天冬氨酸模板的三元絡合物L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp，將含三元絡合物 L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L_Asp 的 S12溶膠薄膜修飾于電極后，洗脫模板分子L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp，即得到印跡有L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp三元絡合物鑄的分子結構的印跡電極。
[0006]如附圖1，D-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp的三元絡合物中，CBZ的苯環與D-Asp上的羧基形成立體阻礙，所以在溶液中該絡合物不穩定，由此所形成該三元絡合物的濃度與L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp的濃度相比很小；而三元絡合物L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L_Asp的穩定性大于D-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp，所以本發明中采用L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L_Asp作為模板分子，這樣所得到的印跡電極對L-Asp-CU2+-N-CBZ-L-Asp三元絡合物具有很強的吸附能力。由此達成吸附L-Asp-CU2+-N-CBZ-L-Asp三元絡合物中銅離子的濃度要遠大于D-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp中銅離子的濃度，通過對銅離子的還原電流的檢測，實現對Asp光學異構體的選擇性識別。由于S12薄膜不對游離的銅離子產生吸附，故對測定不產生干擾。僅有穩定的L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp被富集于修飾電極中，通過銅離子還原電流的檢測達到對L-Asp選擇性識別。
[0007]而反觀D-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp形態的三元絡合物不穩定，濃度很低，以此作為模板分子來制備印跡電極，得不到具有D-Asp-CU2+-N-CBZ-L-Asp鑄型結構的凝膠，而是具有D-Asp或N-CBZ-L-Asp的印跡分子。
[0008]本發明具體的技術方案為:
[0009]提供了一種識別天冬氨酸光學異構體的電化學方法，具體步驟為:
[0010](I)制備 L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp 三元絡合物，
[0011]采用常規方法制備即可；
[0012](2)印跡L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp模板分子的S12溶膠的制備:
[0013]采用溶膠凝膠法，在室溫(25°C)條件下，將0.Sg聚乙二醇(分子量6000)和32.5mL無水乙醇加入四口燒瓶中，升溫至60°C，水浴回流攪拌30min后，加入一定體積(3.6mL)的0.5mM的步驟⑴中所制備的L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp三元絡合物的水溶液，攪拌混合30min，將5mL的0.35M的正硅酸乙酯溶液緩慢加入上述四口燒瓶中后，將溫度升至70°C，水浴回流攪拌6h，待反應結束后，得到含有三元絡合物L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp的S12溶膠，將該溶膠置于30°C恒溫水浴下保存；
[0014](3)印跡L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp三元絡合物模板的S12溶膠修飾電極的制備:
[0015]用微量進樣器移取6 μ L步驟⑵中制備的含有L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp三元絡合物的S12溶膠，均勻滴于GC電極表面，待自然晾干后，再次移取6yL步驟⑵中制備的溶膠均勻滴于GC電極表面，自然晾干后，即得修飾電極；
[0016](4) L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp 三元絡合物模板的脫除:
[0017]以步驟(3)中得到的修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，以鉑絲為對電極，將所述工作電極浸在2% (v/v)醋酸溶液中，于0.1V電位下脫三元絡合物模板500s，即得到具有L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp三元絡合物鑄型的印跡電極，
[0018]將上述脫模板后的印跡電極置于pH為3.0的0.1M的KCl溶液中溶出，若未出現銅離子的還原電流，證明三元絡合物L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp模板完全脫除；
[0019](5)選擇性識別天冬氨酸光學異構體:
[0020]a、以步驟(4)中得到的脫模板后的印跡電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲電極為對電極，將所述工作電極置于不同L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp濃度的富集溶液中富集，將富集L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp后的印跡修飾電極，置于pH為3.0的0.1M KCl溶液中溶出，記錄方波溶出伏安法曲線，并繪制標準曲線，
[0021]b、將未知具體構型的天冬氨酸制備成L-或D-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp三元絡合物，
[0022]C、以步驟(4)中得到的脫模板后的印跡電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲電極為對電極，將所述工作電極置于pH為3.0含有步驟b中所制備的L-或D-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp的富集溶液(富集溶液濃度值在檢測線內)中，開路電位下富集800s后，在pH 3.0的0.1M的KCl緩沖溶液中溶出，記錄方波溶出伏安法曲線，通過與步驟a中得到的標準曲線對比還原峰電流值，實現對天冬氨基酸光學異構體的選擇性識別，
[0023]其中，方波溶出伏安法的掃描電位增量為2.0mV,振幅為50.0mV,脈沖寬度為0.05V，初始電位為-0.4V，終止電位為0.9V，靜置時間為2s。
[0024]本發明的原理如附圖2所示:正硅酸乙酯與模板L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp三元絡合物上的羧酸和氨基氫鍵結合，將三元絡合物包裹在溶膠的網絡結構中，在正硅酸乙酯水解生成溶膠后，S12* S1-O鍵極性較大，表面吸附的水因極化發生解離，形成羥基與模板三元絡合物上的羧基、氨基形成氫鍵，將模板L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp三元絡合物包裹于S1-O-Si的結構中，模板三元絡合物被脫除后，會留下與模板三元絡合物L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp相匹配的空穴，并形成特異性的識別位點，從而達到選擇性識別溶液中三元絡合物L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp的目的。
[0025]本發明技術方案的實質在于:對L-Asp和D-Asp的識別，方案中借助加入N-CBZ-L-Asp形成的三元絡合物穩定性的不同，引起銅離子濃度大小的不同，以銅離子為探針，進行識別測定。
【附圖說明】
[0026]圖1 是 D-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp 和 L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L_Asp 兩種三元絡合物的結構比較圖。
[0027]圖2是本發明中，具有L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp三元絡合物鑄型的印跡電極的制備過程。
[0028]圖3是本發明實施例中，印跡L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp電極對L-Asp的檢測標準曲線，各條曲線按峰的位置自上而下，依次代表的具體濃度分別為0.01,0.03,0.05,0.07、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1.0mM0
【具體實施方式】
[0029](I)制備 L-Asp-Cu2+-N-CBZ-L-Asp 三元絡合物，
[0030]采用常規方法制備即可；
[0031](2)印跡L-Asp-Cu2+