一種基于sers的新城疫病毒檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于光譜學和分子診斷領域，具體涉及一種基于SERS (表面增強拉曼光譜技術)的新城疫病毒檢測試劑盒及其他人檢測方法。
【背景技術】
[0002]新城疫(Newcastle disease, ND)又稱亞洲雞痕，是由新城疫病毒(Newcastledisease virus, NDV)引起的一種以呼吸道、消化道黏膜出血為典型病變的高度接觸性、急性敗血性禽病傳染病，具有較高的發病率和死亡率，被世界動物衛生組織(OIE)列為法定報告動物疫病。ND多年來廣泛存在于各類禽群中，給我國養殖業生產造成巨大的經濟損失。目前，現有的針對新城疫病毒的檢測技術主要包括:病毒分離培養、血凝抑制(HI)試驗、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、RT-PCR和免疫熒光技術等。其中病毒分離培養與酶聯免疫吸附試驗(ELISA)存在耗時長、步驟繁瑣問題；RT-PCR方法雖然能實現具有較高靈敏度的快速檢測，但是要求操作人員具有一定的專業技術能力并且需要昂貴的儀器；免疫熒光技術存在假陽性、熒光猝滅問題。與上述檢測方法相比，本發明建立的檢測方法具有操作簡單、用時少和靈敏度高的優點。
[0003]表面增強拉曼散射(SERS)是通過吸附在金屬納米結構表面上的分子與金屬表面發生的等離子共振(SPR)相互作用而引起的拉曼散射強度增強的現象，目前SERS增強效應平均值約為16數量級。拉曼光譜技術作為一種高靈敏度的表征手段，在微生物的分析和檢測中發揮了重要作用。而目前缺少將拉曼光譜技術應用到新城疫病毒檢測方面的高效試劑盒等研究。
【發明內容】
[0004]為克服上述現有技術中存在的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種基于SERS (表面增強拉曼光譜技術)的新城疫病毒檢測試劑盒。
[0005]本發明的另一目的在于提供上述試劑盒的檢測方法。
[0006]本發明的目的通過下述技術方案實現:一種基于SERS的新城疫病毒檢測試劑盒，包括拉曼探針溶液和硝酸纖維素膜；
[0007]所述的拉曼探針溶液包括新城疫抗體、3，3’ -二硫雙(6-硝基苯甲酸)雙琥珀酸亞胺酯(DSNB)和膠體金溶液，所述的拉曼探針溶液為納米金、3，3’-二硫雙(6-硝基苯甲酸)雙琥珀酸亞胺酯復合物與新城疫抗體偶聯溶液。
[0008]所述的新城疫抗體為新城疫單克隆抗體或新城疫多克隆抗體。
[0009]所述的膠體金溶液中納米金顆粒的直徑為20nm，濃度為9 X 111顆粒/mL。
[0010]所述的納米金顆粒，通過下述制備方法獲得:將ImL的質量分數I %氯金酸(HAuCL4)溶解于10mL超純水中，隨后加入2mL的質量分數I %檸檬酸鈉溶液(Na3C6H5O7)，并用0.1M碳酸鉀(K2CO3)將pH調至7，上述溶液在有冷凝回流裝置中50°C _100°C加熱20-30分鐘，直到顏色變成深紫色；得到納米顆粒經光子相關光譜測量大小約為20nm，濃度為 9X1011 顆粒/mL。
[0011]所述的3，3’-二硫雙(6-硝基苯甲酸)雙琥珀酸亞胺酯(DSNB)，通過下述的制備方法獲得:取10mL圓底雙口燒瓶，氮氣條件下，加入50mL干燥四氫呋喃，加入0.5g的5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)溶解，再加入0.29g的N-羥基丁二酰亞胺，冰浴，加入0.42mL 二環己基碳二亞胺，撤去冰浴，室溫下，回流攪拌12h ;抽濾反應液，取濾液，40°C下旋蒸除去溶劑得到粗產品，使用丙酮重結晶，獲得3，3’-二硫雙(6-硝基苯甲酸)雙琥珀酸亞胺酯。
[0012]所述的納米金、3，3’ -二硫雙(6-硝基苯甲酸)雙琥珀酸亞胺酯復合物與新城疫抗體偶聯溶液，通過以下方法制備獲得:
[0013](I)納米金與3，3’-二硫雙(6-硝基苯甲酸)雙琥珀酸亞胺酯偶聯，具體制備步驟為:稱Img的3，3’-二硫雙(6-硝基苯甲酸)雙琥珀酸亞胺酯在1.5mL離心管，加入100 μ LACN (乙腈)，完全溶解變澄清；取30 μ L加入ImL膠體金溶液(濃度為9 X 111顆粒/mL, OD = 3.0的膠體金溶液對半稀釋)，渦旋混勻；室溫震蕩過夜，獲得納米金與3，3’ - 二硫雙(6-硝基苯甲酸)雙琥珀酸亞胺酯偶聯溶液；
[0014](2)納米金、3，3’_ 二硫雙(6-硝基苯甲酸)雙琥珀酸亞胺酯復合物與新城疫抗體偶聯:將步驟(I)中室溫震蕩過夜溶液，12000rpm，1min離心，底部可見深紫色小點；移除上清液，用等體積的超純水重新懸浮納米金，12000rpm，1min再次離心去除3，3’ - 二硫雙(6-硝基苯甲酸)雙琥珀酸亞胺酯；移除上清液，用ImL超純水重懸納米金溶液；取I yL的lmg/mL的新城疫抗體加入到ImL的納米金和3，3’ - 二硫雙(6-硝基苯甲酸)雙琥泊酸亞胺酯(DSNB)混合液中；渦旋混勻，室溫震蕩過夜后獲得。
[0015]應用上述試劑盒進行新城疫病毒檢測的方法，包括以下步驟:
[0016]將新城疫病毒滴入硝酸纖維素膜中，室溫干燥后，將硝酸纖維素膜浸泡于5 %的脫脂奶粉，置于37°C搖床封閉Ih ;TBST洗膜3次，每次5min ;取出硝酸纖維素膜浸泡于拉曼探針溶液，37°C搖床孵育lh，TBST洗膜3次，每次5min ;待硝酸纖維素膜干燥后，利用拉曼光譜儀對免疫復合物進行拉曼檢測，即可以高特異性的識別待測物增強的拉曼分子信號，實現新城疫病毒的檢測。
[0017]所述的拉曼光譜儀為SmartRaman便攜式拉曼光譜儀。
[0018]所述的拉曼光譜儀檢測條件為:激光波長785nm，激光功率為100mW、積分時間為3s、波數范圍是700-2000cm 1O
[0019]本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:
[0020]本發明是基于SERS的新城疫病毒檢測試劑盒及其檢測方法。應用SERS的免疫檢測技術，首先將病毒滴入硝酸纖維素膜中，經過封閉、洗滌步驟后加入偶聯抗體的拉曼探針，這樣就在硝酸纖維素膜上形成了 “固相抗原-標記抗體”半夾心的免疫復合物，對該免疫復合物進行拉曼光譜檢測，即可高特異性地識別待測物的增強的拉曼分子信號。本發明的檢測方法可以用于高靈敏度的新城疫病毒檢測。
【附圖說明】
[0021]圖1是本發明的新城疫病毒特異性檢測結果圖，其中，圖中A表示新城疫病毒樣品拉曼光譜檢測圖，B表示禽流感病毒樣品拉曼光譜檢測圖，C表示SPF雞胚尿囊液樣品拉曼光譜檢測圖。
[0022]圖2是本發明的新城疫病毒靈敏度檢測結果圖，圖中A、B、C分別表示新城疫病毒100倍、1000倍、10000倍稀釋后的拉曼光譜圖。
【具體實施方式】
[0023]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0024]下述實施例中所用的材料、試劑等如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0025]實施例1
[0026]本發明中提供了一種基于SERS (表面增強拉曼光譜技術)的新城疫病毒檢測試劑盒及其檢測方法，具體步驟如下:
[0027](I)納米金的制備:將ImL的質量分數I %氯金酸(HAuCL4)溶解于10mL超純水中，隨后加入2mL的質量分數I %檸檬酸鈉溶液(Na3C6H5O7)，大約用ImL的0.1M碳酸鉀(K2CO3)將pH調至7 ;上述溶液在有冷凝回流裝置中50°C -100°C加熱20-30分鐘，直到顏色變成深紫色。得到納米顆粒經光子相關光譜測量大小約為20nm，濃度為9X 111顆粒/mL ;
[0028](2)3，3’ - 二硫雙(6-硝基苯甲酸)雙琥珀酸亞胺酯的制備:取10mL圓底雙口燒瓶，氮氣條件下，加入50mL干燥四氫呋喃，加入0.5g的5，5’- 二硫雙(2-硝基苯甲酸)溶解，再加入0.29g的N-羥基丁二酰亞胺，冰浴，加入0.42mL 二環己基碳二亞胺，撤去冰浴，室溫25°C下，回流攪拌12h;抽濾反應液，取濾液，40°C下旋蒸除去溶劑得到粗產品，使用丙酮重結晶得到純品；
[0029](3)納米金與3，3’-二硫雙(6-硝基苯甲酸)雙琥珀酸亞胺酯偶聯:稱Img3，3’-二硫雙(6-硝基苯甲酸)雙琥珀酸亞胺酯在1.5mL離心管，加入100 μ L ACN(乙腈)，會完全溶解變澄清；取30 μ L加入ImL液體金水溶液(原溶液OD = 3.0溶液對半稀釋)，渦旋混勻；室溫震蕩過夜；
[0030](4)納米金、3，3’ - 二硫雙(6-硝基苯甲酸)雙琥珀酸亞胺酯復合物與抗體偶聯:將上述4°C過夜溶液，12000rpm，1min離心，可見深紫色小點在底部；移除上清液，用等體積的超純水