具有一次性流體路徑的液體到液體生物粒子濃縮器的制造方法
【專利說明】
[0001] 該專利申請是于2013年11月19日提交的美國專利申請序列號14/084,385的 部分繼續申請；并且該專利申請要求于2013年2月26日提交的美國臨時專利申請序列號 61/769, 672的優先權，其內容在此通過本文的引用以其整體被并入本公開。
技術領域
[0002] 主題公開總體涉及樣品制備的領域。更具體地，主題公開涉及一種粒子的自動化 濃縮的方法和裝置用于增強隨后分析方法的靈敏度。
【背景技術】
[0003] 檢測和定量液體中的稀釋材料的困難是眾所周知的。隨著分析物濃度降低，現有 的系統全部開始失靈，最終導致在非常低的濃度下檢測不到分析物。這對國家安全構成了 重大問題，例如2001年的郵政炭疽襲擊和隨后的反恐戰爭已經揭示了在生物威脅的取樣 和檢測方面的不足之處。與環境科學一樣，現有的檢測極限類似地影響醫學領域。
[0004] 對溶液中的粒子進行定量的現有分析系統的檢測極限不會使它們不適合用于對 落在這些極限以下的分析物或粒子進行研究。而是，需要在分析前對粒子進行濃縮的方法。
[0005] 通常使用離心分離進行液體中的粒子濃縮。根據混合物中出現的單個成分的密度 差異，將離心力用于混合物的分離。這種力分離混合物，在管的底部形成相對致密的材料的 小球。然后可以將被稱為上清液或上層液體的剩余溶液在不擾動小球的情況下小心地從管 中倒出或使用巴斯德移液器取出。離心分離的速率由對樣品施加的加速度規定，且通常以 每分鐘轉數（RPM)或重力進行測量。離心分離中的粒子沉降速度是粒子尺寸和形狀、離心 加速度、存在的固體的體積分數、粒子與液體之間的密度差和液體粘度的函數。
[0006] 離心分離技術所具有的問題限制它的適用性。微米尺寸范圍的粒子的沉降速度非 常低，因此這些粒子的離心濃縮需要幾分鐘至幾小時。實際的時間根據樣品的體積、所用的 設備和操作員的技術而變化。離心分離的性質和用以進行離心分離的裝置的性質需要熟練 的操作員，由此使得難以自動化和集成到其它系統中。
[0007] 離心分離技術是冗長的，因為其通常由多個步驟組成，所述多個步驟各自需要來 自操作員的高度專注。在大多數微生物學實驗室中，每天通過離心分離處理大量的樣品是 很常見的。由于該冗長的性質而導致人為錯誤的可能性是高的；且如前所述，這些技術的自 動化是困難和昂貴的。
[0008] 已經探索了其它的濃縮技術且其主要落在三個技術類別內-微流體/電泳類、過 濾類和捕獲類。這些技術各自具有優缺點。
[0009] 傳統的平面過濾方法用于從液體中將粒子捕獲在通常由濾網或多孔襯底支撐的 平面過濾器上。存在許多不同的過濾方法，但目的都在于實現兩種以上物質的分離。這通 過要被去除的物質或物體與過濾器之間的某種形式的相互作用而實現。通過過濾器的物質 必須是流體，即液體或氣體。最簡單的過濾方法為使固體和流體的溶液通過多孔的界面，使 得固體被捕獲而液體通過。該原理依賴于在流體中含有的粒子之間的尺寸差異，所述粒子 組成所述固體。在實驗室中，如果經常做的話，這使用具有用作多孔隔板的濾紙的布氏漏斗 來完成。
[0010] 物理阻擋過濾方法的一個缺點在于，被從流體中濾出的物質將會隨時間阻塞穿過 過濾器的通道。流過過濾器的阻力隨著時間變得越來越大，就好像例如吸塵器袋。因此，已 經開發了方法以防止這種現象發生。這些方法大多數涉及更換過濾器；然而，如果需要將過 濾器用于連續過程，則這種更換的需要是很成問題的。可能會使用刮擦和原位清潔機制，但 這些是不必要地復雜和昂貴的。
[0011] 在一個實施例中，通過如下可以將細菌從水中去除：使它們通過支撐在布氏漏斗 中的過濾器以在平面過濾器上捕獲細菌。也可以以相同方式捕獲含有生物材料的氣溶膠粒 子。為了分析，通常將捕獲的材料再懸浮在已知體積的液體中。這允許反向計算原始氣溶 膠濃度。由埃奇伍德化學生物中心驗證的一種方法使用47mm的玻璃纖維過濾器來捕獲參 比樣品用于生物分析。通過如下提取細菌：將所述過濾器浸泡在20mL的緩沖鹽水溶液中過 夜，然后渦旋3分鐘以將過濾器材料完全瓦解。然后提供的這些懸浮液的子樣品或等份試 驗以用于通過存活培養、PCR或其它方法進行分析。
[0012] 存在用于濃縮生物微粒物的其它技術。圣地亞國家實驗室、麻省理工學院和其他 組織已經開發了通過介電泳或電泳分離和濃縮粒子的微流體裝置。這些單元使用微通道和 電場來移動或收集粒子。圣地亞還開發了在兩種不相溶的液體之間的界面處濃縮粒子的系 統。免疫磁性粒子可商購用于細菌的分離和濃縮。
[0013] 存在用于在檢測前濃縮液體中的有機體的各種方法。歷史上，最常用的方法是在 營養液體培養基中使樣品富集，然后在瓊脂板上培養液體培養基的一小份。這種方法的最 大缺點是時間需求。在能夠在板上計數有機體之前，其通常需要五至七天。其它濃縮方法 包括各種過濾類方法、吸附-洗脫、免疫捕獲、絮凝和離心分離。成問題的是：迄今還沒有開 發出能夠將大體積的水快速濃縮成非常小的樣品體積并高效地完成這一任務的方法。實際 上，這些方法大多數在這些領域中的每一個中都是失敗的，最顯著的是濃縮效率和易用性。 已經使用中空纖維超濾進行了大量研究以從大體積的水中濃縮細菌、病毒和原生動物。所 述方法大多數都不是自動化的。
[0014] 通常，這些系統能夠將IOL~100L的水濃縮成IOOmL~500mL的濃縮的樣品；然 而，問題進一步在于，所展示的技術都不提供濃縮成小于IOOmL體積。當濃縮器系統與下游 檢測器械聯接時，即便這一體積也遠大于最好的可能檢測所期望的體積。這意味著需要昂 貴且耗時的第二人工濃縮步驟以使最終樣品達到期望的體積。
[0015] 盡管上述替代濃縮系統是自動化的，但相對于用于許多實驗室的傳統離心分離并 未提供顯著的優點，所述實驗室包括微生物學、生物技術和臨床生物學實驗室。這些實驗室 需要高度確信不會發生樣品到樣品的污染。所述替代自動化濃縮系統具有大量流體，樣品 會暴露于所述流體，且在許多情況下，最好的是以高的代價更換樣品之間的這些流體管線， 而最壞的是不能更換樣品之間的這些流體管線。
[0016] 將感興趣的粒子或標記從一個樣品攜帶到另一個的可能性和在系統流體內生長 細菌的可能性顯著地限制它們對臨床實驗室的適用性。通常，微生物和生物技術實驗室已 經在幾乎全部工作中都采用了使用一次性部件。
[0017] 能夠從相對大體積的液體中濃縮生物材料的具有一次性液路的濃縮系統將會對 臨床診斷以及微生物學和生物技術實驗室具有顯著的適應性。吸附柱是如今在這些實驗室 中得到廣泛使用的相對新的裝置，其含有超濾器或微過濾器型膜過濾器且能夠被放置到離 心機中或在某些情況下使用正壓來驅動流體通過。
[0018] 這些離心機吸附柱克服了與其它濃縮系統相關的污染問題且還克服了與使用離 心分離來濃縮生物材料相關的許多問題；然而，吸附柱由于其復雜性而是昂貴的，且在操作 期間仍需要顯著的人工操作和移液。其所用仍需要相當高的技術水平。
【發明內容】
[0019] 通過提供具有被封裝在一次性末端中的樣品流體管線和過濾器的高效的基于過 濾的濃縮系統，本公開解決了概述的問題并推進本領域。一次性末端附接到儀器所借助的 所有導管被組合到末端的上端上的單個連接點中。進一步地，在末端的下端處的漸縮的末 端使得能夠與預過濾器和/或附加的管連接。為了操作系統，新的干凈的末端被附接到濃 縮器單元，并且下開口浸蘸到被包含在適當的樣品容器中的液體樣品中并且單元被激活。 樣品然后被吸入末端中，在末端中樣品與過濾器接觸。在大于過濾器孔隙尺寸的粒子和分 子被捕獲和保留的同時液體穿過。當全部樣品已經被處理時，末端的下開口被放到適當的 樣品容器中并且使用洗脫流體或泡沫洗脫捕獲的材料并且將其以減小的體積分送。
[0020] 在分送濃縮的樣品之前，也能夠通過將小體積的液體推入或吸入到纖維腔中、將 其通過過濾器壁抽出或在將其抽出之前將其留在纖維腔中一段時間來執行洗滌步驟、標記 步驟、細胞溶解或其它操作。
[0021] 在一個示例性實施例中，本主題公開是一種裝置，包括：被包圍在外殼內的過濾 器，所述外殼包括用于抽吸位于所述外殼的底端處的流體樣品的開口和位于所述外殼的頂 端處的洗脫端口，所述過濾器在豎直取向上被定位，并且所述過濾器從所述頂端到所述底 端跨越所述外殼的長度，其中在所述流體樣品中的多個粒子被從所述過濾器的滯留物表面 洗脫，并通過所述開口以減小的流體體積被分送。裝置進一步包括連接部分，該連接部分用 于將洗脫端口連接到濃縮單元。
[0022] 在另一個示例性實施例中，本主題公開是一種裝置，包括：外殼的第一半部，所述 外殼的所述第一半部被聯接到第一過濾器，所述第一過濾器豎直取向并跨越所述外殼的所 述第一半部的長度；和外殼的第二半部，所述外殼的所述第二半部被聯接到第二過濾器，所 述第二過濾器豎直取向并跨越所述外殼的所述第二半部的長度，其中所述外殼的所述第一 半部和所述第二半部被夾在一起，以形成濃縮移液器末端，并且在所述流體樣品中的多個 粒子被從所述第一過濾器和所述第二過濾器的滯留物表面洗脫，并通過與外殼的底端鄰近 定位的開口以減小的流體體積被分送。
[0023] 在又另一個不例性實施例中，本主題公開是一種裝置，包括：外殼、被包圍在外殼 內的過濾器、開口、洗脫端口和滲透物抽取部，過濾器豎直取向并且跨越外殼的長度，開口 被與外殼的底端鄰近地定位用于抽吸流體樣品，洗脫端口被與外殼的頂端鄰近地定位用于 接收洗脫流體，滲透物抽取部被與外殼的頂端鄰近地定位，滲透物抽取部用于將外殼聯接 到真空源聯接，其中流體樣品中的多個粒子被從過濾器的滯留物表面切向洗脫并通過所述 開口被分送。
【附圖說明】
[0024] 圖IA和IB示出根據本主題公開的示例性實施例的濃縮移液器末端（CPT)。
[0025] 圖2A和2B示出根據本主題公開的示例性實施例的不允許空氣穿過的用于中空纖 維過濾器的類似構造。
[0026] 圖3示出根據本主題公開的示例性實施例的用于濃縮移液器末端（CPT)與濃縮器 單元的連接的替代構造。
[0027] 圖4示出根據本主題公開的示例性實施例的包括用于與濃縮單元連接的環形構 造的CPT。
[0028] 圖5示出根據本主題公開的示例性實施例的具有針式連接器的CPT。
[0029] 圖6示出根據本主題公開的示例性實施例的包括主要的公連接器的CPT。
[0030] 圖7示出根據本主題公開的示例性實施例的包括主要的公連接器的CPT。
[0031] 圖8示出根據本主題公開的示例性實施例的包括主要的公連接器的CPT。
[0032] 圖9-11示出根據本主題公開的示例性實施例的用于CPT的一種構造。
[0033] 圖12示出根據本主題公開的示例性實施例的用于CPT的另一個可能的構造。
[0034] 圖13示出根據本主題公開的示例性實施例的用于具有平面的多孔表面的CPT的 構造，平面的多孔表面將末端劃分成上部和下部，其中開口在下端處，連接器在上端處。
[0035] 圖14A-C示出根據本主題公開的示例性實施例的用于CPT的另一個構造。
[0036] 圖15示出根據本主題公開的示例性實施例的通過CPT聚集樣品的濃縮單元。
[0037] 圖16示出根據本主題公開的示例性實施例的使用具有CPT的濃縮單元的方法。
[0038] 圖17A和17B示出根據本主題公開的示例性實施例的用于CPT的替代的構造。
[0039] 圖18A和18B示出根據本主題公開的示例性實施例的用于通過CPT聚集樣品的另 一個濃縮單元。
[0040] 圖19示出根據本主題公開的示例性實施例的用于通過CPT聚集樣品的系統。
[0041] 圖20示出根據本主題公開的示例性實施例的具有平面過濾器的CPT的外視圖。
[0042] 圖21示出根據本主題公開的示例性實施例的具有平面過濾器的CP