一種用于肺癌診斷的sall4免疫組織化學檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用于肺癌診斷的SALL4免疫組織化學檢測試劑盒、使用方法及應 用，屬于醫學和生物學檢測領域。
【背景技術】
[0002] 肺癌是當今全球最常見的惡性腫瘤之一，危害嚴重并呈上升趨勢，是全球發病率 和死亡率增加最快的疾病。肺癌的高病死率主要是由于無法做到早期診斷，因此，肺癌的早 期診斷是及時規范治療并改善其預后的最有效措施。目前傳統的診斷方法依賴于影像學和 纖維支氣管鏡檢查，但是這兩種方法具有操作復雜、有輻射副作用及費用高等局限。腫瘤標 志物的發現和合理應用對腫瘤早期發現、早期診斷具有重要意義。
[0003] 腫瘤標志物是腫瘤細胞在癌變過程中由于基因的表達水平的變化而生成或減少 的抗原和其它生物活性物質，可用于腫瘤的早期診斷、分期、監測腫瘤進程和評價藥物的治 療效果。腫瘤標志物會對腫瘤的臨床治療帶來巨大的影響，尤其當其能夠在臨床病癥出現 之前被檢測到，或者可以用于治療效果的實時檢測時。與傳統的診斷手段相比，腫瘤標志物 檢測具有簡便、費用相對低、沒有輻射危害、風險小、病人容易接受等優點。目前，為了滿足 腫瘤的臨床診斷和治療的需求，腫瘤標志物的研發亟待加速。
[0004] 目前用于腫瘤早期診斷的腫瘤標志物，大多由于缺乏靈敏度和特異性而不能在實 際檢測中廣泛應用。例如，對于肝癌，甲胎蛋白和超聲波檢查是普遍采用的診斷高危病人的 方式，并且確實顯著提高了肝癌病人的生存率，但靈敏度比較低；腫瘤抗原CA-125有更高 的靈敏度，但卻缺乏特異性。同樣地，用于乳腺癌檢測的血液腫瘤標志物CA15-3因靈敏度 低，在早期診斷中幾乎沒用。腫瘤的早期診斷、以及良性和惡性腫瘤的區分仍然是一個臨床 難題，需要新的技術和方法來發現新的腫瘤標志物和提高腫瘤標志物檢測的靈敏度和可信 度。而針對高發病率和死亡率的肺癌，尋找高敏感性和特異性的標志物，對肺癌的診斷和治 療具有重大意義，已成為肺癌防治的當務之急。
[0005] SALL4蛋白由人源基因 SALL4編碼翻譯，其全稱為Sal樣蛋白4(Sal-like protein 4)，別名鋅指蛋白 797 (Zinc finger protein 797)和鋅指蛋白 SALL4 (Zinc finger protein SALL4)。SALL4屬于Sal C2H2類鋅指蛋白家族，包含有C2H2類鋅指結構。SALL4 蛋白有兩個亞型，即SALL4A和SALL4B，其分子量大小分別為112. 2KD和65. 7KD。SALL4蛋 白主要分布在細胞質和細胞核中。
[0006] SALL4屬于鋅指轉錄因子，通過與0CT3/4、S0X2及NANOG相互作用，參與干細胞的 自我更新和維持。SALL4不但在胚胎干細胞中高表達，而且在人造血系統腫瘤中也高表達， 例如急性粒細胞和淋巴細胞白血病。進一步發現SALL4能夠上調原癌基因 Bmi-I在人造血 干細胞和白血病細胞中的表達。其它一些研究表明，SALL4可以作為腫瘤標記物，在肺癌和 乳腺癌的診斷中具有較高的應用價值。SALL4 mRNA在肺癌敏感性和特異性分別為85. 1% 和92.9%，93%的肺癌標本541^4 1111^^是癌旁的兩倍。關于541^4蛋白在肺癌細胞中的表 達，以及作為一種肺癌標志物進行肺癌診斷的可行性，目前尚無相關報道。
[0007] 目前，在臨床上，免疫組織化學染色已經在腫瘤病理診斷中得到了廣泛應用，涉 及領域包括腫瘤組織起源的鑒別、未分化惡性腫瘤性質的判定、各種形態系統腫瘤鑒別、確 定腫瘤原發部位等。其原理是用標記的抗體對細胞或組織內的相應的抗原進行定性、定位 或定量檢測，經過組織化學的呈色反應而呈現醒目的陽性色彩，再用光學顯微鏡、熒光顯微 鏡或電子顯微鏡觀察。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的之一，是提供一種用于肺癌診斷的SALL4免疫組織化學檢測試劑盒 及其使用方法，可有效地區分肺癌組織和正常組織，還可為肺癌個體化治療提供新的診斷 和分類依據。
[0009] 本發明的目的之二，是提供一種用于肺癌診斷的SALL4免疫組織化學檢測試劑盒 的應用。
[0010] 本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種用于肺癌診斷的SALL4免疫組織 化學檢測試劑盒，包括如下組分：陽性對照、陰性對照、一抗、二抗、固定劑、脫脂和透明劑、 復水劑、脫水劑、緩沖液A、緩沖液B、抗原修復劑、通透劑、過氧化物酶失活劑、非特異性蛋 白阻斷劑、顯色液和染色劑。
[0011] 在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。
[0012] 進一步，所述陽性對照為SALL4高表達的精原細胞瘤組織，所述陰性對照為：不含 SALL4抗體的羊血清孵育的肺鱗癌組織。
[0013] 進一步，所述一抗為小鼠來源的抗人SALL4單克隆抗體，所述二抗為生物素標記 的山羊抗小鼠 IgG，所述固定劑為福爾馬林，所述脫脂和透明劑為二甲苯，所述復水劑為濃 度為100 % v/v、90 % v/v、80 % v/v、70 % v/v的梯度酒精，所述脫水劑為濃度為70 % v/ v、80% v/v、90% v/v、100% v/v的梯度酒精，所述緩沖液A為ImM PBS(PH7. 4)，所述緩沖 液B為ImM PBST(PH7. 4)，所述抗原修復劑為ImM Tris/EDTA(PH8)，所述通透劑為0. 3% Triton-100,所述過氧化物酶失活劑為3 % v/v的過氧化氫，所述非特異性蛋白阻斷劑為 〇. 5%羊血清，所述顯色液為DAB，所述染色劑為蘇木精。
[0014] 一種用于肺癌診斷的SALL4免疫組織化學檢測試劑盒的使用方法，包括如下步 驟：
[0015] (1)取待測樣品和陽性對照分別進行福爾馬林固定，4°C放置12小時；
[0016] (2)將步驟所得⑴固定標本，進行石蠟包埋，制成4 μπι厚石蠟切片，置于37°C干 燥12小時，得到干燥后的切片；
[0017] (3)脫蠟復水：將步驟⑵所得干燥后的切片，于60°C烘烤2小時，再用脫脂和透 明劑脫蠟5分鐘，然后用復水劑復水，每梯度2分鐘，再用無菌水沖洗2分鐘，得到復水切 片；
[0018] (4)將步驟（3)所得復水切片，加入通透劑，對組織進行通透，室溫放置3分鐘，移 去通透劑，再用洗滌劑沖洗5分鐘，得到通透切片；
[0019] (5)將步驟（4)所得通透切片，用過氧化物酶失活劑浸泡10分鐘，進行內源性過氧 化物酶活性封閉，再用緩沖液A沖洗5分鐘，得到內源性過氧化酶失活切片；
[0020] (6)將步驟（5)所得內源性過氧化物酶失活切片，置于抗原修復劑中，沸水煮3分 鐘，進行抗原修復，室溫冷卻，用緩沖液A沖洗5分鐘，得到抗原修復切片；
[0021] (7)將步驟（6)所得抗原修復切片，加非特異性蛋白阻斷劑，常溫封閉1小時，得到 非特異性抗體封閉切片；
[0022] (8)將步驟（7)所得非特異性抗體封閉切片，除陰性對照只加非特異性蛋白阻斷 劑，其余切片均加非特異性蛋白阻斷劑稀釋的10 μ g/ml的一抗，然后室溫孵育2小時，依次 用緩沖液A和緩沖液B沖洗，各沖洗3次，每次5分鐘，得到一抗后的切片；
[0023] (9)將步驟（8)所得一抗后的切片，加入200倍非特異性蛋白阻斷劑稀釋的二抗， 室溫孵育1小時，依次用緩沖液A和緩沖液B沖洗，各沖洗3次，每次5分鐘，得到二抗后的 切片；
[0024] (10)將步驟（9)所得二抗后切片，用新鮮配制的顯色液染色，室溫孵育5分鐘，得 到染色后的切片；
[0025] (11)將步驟（10)所得染色后的切片，自來水沖洗3分鐘，染色劑復染3分鐘，自 來水沖洗3分鐘，得到復染切片；
[0026] (12)將步驟（11)所得復染切片，用脫水劑脫水干燥，每梯度2分鐘，再用脫脂和透 明劑透明5分鐘，中性樹膠封固，即得SALL4免疫組織化學染色切片；
[0027] (13)將步驟（12)所得SALL4免疫組織化學染色切片，置于光學顯微鏡下，觀察染 色程度、統計陽性細胞數目，再結合陽性對照和陰性對照的結果，判斷待測樣品是否為肺癌 組織。
[0028] 在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。
[0029] 進一步，步驟（1)所述待測樣品，為從病