核酸適配體在識別并結合l選擇素中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術與臨床醫學技術領域，具體涉及核酸適配體在識別并結合L 選擇素中的應用。
【背景技術】
[0002] 核酸適配體（aptamer)是一類能與祀標物質特異性相互作用的單鏈DNA、RNA、肽 核酸或化學修飾的核酸序列，通常由15-80個核苷酸組成。核酸適配體可以形成特定的三 維結構與靶標分子高親和力結合，如發卡、假結、G-四鏈體等結構，高特異性地結合作用是 通過范德華力、氫鍵、靜電作用和疏水作用等分子間相互作用實現的。由于核酸適配體具有 親和力高、特異性好、無免疫原性、易合成、改造與修飾、生物化學穩定性好、能可逆變性與 復性等特性，所以被稱之為"化學抗體"。
[0003] 核酸適配體可被應用在一些疾病的診斷和檢測、藥物靶點定位、新藥研發和運輸 相關藥物分子等領域，目前，用于治療癌癥、艾滋病等疾病的核酸適配體也不斷涌現。例如， 由Eyetch/Pfizer開發的革El向VEGF的核酸適配體（商品名Macugen) 2004年已獲得FDA的 批準，成功地用于治療年齡相關的黃斑變性。近年提出的利用細胞-SELEX技術篩選特異性 核酸適配體，進而發現腫瘤標志物的方法具有好的應用前景。但目前只有極少數成功的例 子，其中的瓶頸問題就在于位于細胞膜上的核酸適配體靶分子的純化/鑒定。
[0004] L選擇素又稱CD62L、白細胞內皮細胞黏附分子-I (LECAM-I)、淋巴結歸巢受體和 MEL-14。L選擇素胞膜外區N端有1個C型凝集素樣結構域、1個EGF樣結構域和2個CCP 結構域。L選擇素表達于造血細胞某些分化階段，包括大多數B細胞和未致敏T細胞以及大 多數單核細胞、中性粒細胞和嗜酸粒細胞。PMA、細胞因子或趨化劑刺激淋巴細胞和中性粒 細胞后，由于蛋白酶的酶解作用使L選擇素迅速消失，而使血漿中有很高水平的可溶型L選 擇素。L選擇素是體內一種重要的免疫調節因子，可參與細胞的伸展與移動、細胞的信號傳 導與活化，是炎癥反應、免疫應答、血栓形成、腫瘤轉移、創傷愈合等多種生理、病理過程，通 過測定細胞表面L選擇素的含量及血清、血漿或其他體液中sL選擇素的濃度可以判斷疾病 的程度和分析發生機制，對于監測一些炎性或免疫性疾病的發生、發展及治療效果可能是 一個潛在的實用指標。
【發明內容】
[0005] 本發明的一個目的是提供核酸適配體或其衍生物的新用途。
[0006] 本發明提供了核酸適配體或其衍生物在識別并結合或輔助識別并結合L選擇素 中的應用；
[0007] 或核酸適配體或其衍生物在制備識別并結合或輔助識別并結合L選擇素的產品 中的應用；
[0008] 所述核酸適配體為序列1所示的單鏈DNA分子。
[0009] 本發明還提供了核酸適配體或其衍生物在檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有L 選擇素中的應用；
[0010] 或核酸適配體或其衍生物在檢測或輔助檢測待測樣品中L選擇素含量中的應用；
[0011] 或核酸適配體或其衍生物在制備檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有L選擇素 的產品中的應用；
[0012] 或核酸適配體或其衍生物在制備檢測或輔助檢測待測樣品中L選擇素含量的產 品中的應用；
[0013] 所述核酸適配體為序列1所示的單鏈DNA分子。
[0014] 本發明還提供了核酸適配體或其衍生物在檢測與抗L選擇素的抗體結合的物質 中的應用；
[0015] 或核酸適配體或其衍生物在制備檢測與抗L選擇素的抗體結合的物質的產品中 的應用；
[0016] 所述核酸適配體為序列1所示的單鏈DNA分子。
[0017] 本發明還提供了核酸適配體或其衍生物在制備診斷和/或治療炎性疾病或免疫 性疾病的產品中的應用；
[0018] 所述核酸適配體為序列1所示的單鏈DNA分子。
[0019] 上述應用中，所述衍生物為如下（1)-(6)任一所述的核酸適配體的衍生物：
[0020] (1)將序列1所示的核酸適配體刪除或增加一個或幾個核苷酸，得到與所述核酸 適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0021] (2)將序列1所示的核酸適配體進行核苷酸取代或修飾，得到與所述核酸適配體 具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0022] (3)將序列1所示的核酸適配體的骨架改造為硫代磷酸脂骨架，得到與所述核酸 適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0023] (4)由序列1所示的核酸適配體編碼的RNA分子，得到與所述核酸適配體具有相同 功能的核酸適配體衍生物；
[0024] (5)由序列1所示的核酸適配體編碼的肽核酸，得到與所述核酸適配體具有相同 功能的核酸適配體的衍生物；
[0025] (6)將序列1所示的核酸適配體的一端或中間接上信號分子和/或活性分子和/ 或功能基團，得到與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0026] 所述（6)中的功能基團為生物素基團或熒光基團。
[0027] 上述應用中，所述核酸適配體的衍生物為在上述核酸適配體的5'端或3'端標記 熒光基團或生物素基團。
[0028] 上述應用中，所述核酸適配體的衍生物為在上述核酸適配體的5'端標記熒光基團 或生物素基團。
[0029] 上述應用中，所述待測樣品為細胞；所述細胞具體為大鼠肺泡上皮細胞RAEC、人 胚胎肺纖維細胞MRC-5、人肺泡上皮細胞A549、人宮頸癌細胞Hela、人肝癌細胞Huh-7、人膀 胱癌細胞T24、人肝細胞癌細胞SK-Hep-I、人乳腺癌細胞MCF-7、人乳腺癌細胞MCF-7R、人卵 巢癌細胞SK0V-3、人白血病細胞K562、人乳腺癌細胞MDA-MB-231、人類上皮癌細胞A431、人 類T細胞白血病細胞Jurkat E6-1、人回盲腸腺癌細胞HCT-8、人胚胎腎細胞HEK-293、人前 列腺癌細胞PC-3、人類T細胞淋巴瘤Hut-78、人結腸癌細胞LoVo、急性淋巴母細胞白血病細 胞Molt-4、人T淋巴瘤細胞Sup-Tl或人B細胞淋巴瘤細胞M〇2058。
[0030] 本發明的另一個目的是提供一種產品。
[0031] 本發明提供的產品的活性成分為序列1所示的核酸適配體或其衍生物；所述產品 的用途為如下1)-5)中的至少一種：
[0032] 1)識別并結合或輔助識別并結合L選擇素；
[0033] 2)檢測或輔助檢測與抗L選擇素的抗體結合的物質；
[0034] 3)檢測或輔助檢測待測樣品中L選擇素的含量；
[0035] 4)檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有L選擇素；
[0036] 5)診斷和/或治療炎性疾病或免疫性疾病。
[0037] 上述產品中，所述衍生物為如下（1) - (6)任一所述的核酸適配體的衍生物：
[0038] (1)將序列1所示的核酸適配體刪除或增加一個或幾個核苷酸，得到與所述核酸 適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0039] (2)將序列1所示的核酸適配體進行核苷酸取代或修飾，得到與所述核酸適配體 具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0040] (3)將序列1所示的核酸適配體的骨架改造為硫代磷酸脂骨架，得到與所述核酸 適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0041] (4)由序列1所示的核酸適配體編碼的RNA分子，得到與所述核酸適配體具有相同 功能的核酸適配體衍生物；
[0042] (5)由序列1所示的核酸適配體編碼的肽核酸，得到與所述核酸適配體具有相同 功能的核酸適配體的衍生物；
[0043] (6)將序列1所示的核酸適配體的一端或中間接上信號分子和/或活性分子和/ 或功能基團，得到與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0044] 所述功能基團為生物素基團或熒光基團。
[0045] 上述產品中，所述核酸適配體的衍生物為在上述核酸適配體的5'端或3'端標記 熒光基團或生物素基團。
[0046] 上述產品中，所述核酸適配體的衍生物為在上述核酸適配體的5'端標記熒光基團 或生物素基團。
[0047] 上述產品中，所述待測樣品為細胞；所述細胞具體為大鼠肺泡上皮細胞RAEC、人 胚胎肺纖維細胞MRC-5、人肺泡上皮細胞A549、人宮頸癌細胞Hela、人肝癌細胞Huh-7、人膀 胱癌細胞T24、人肝細胞癌細胞SK-Hep-I、人乳腺癌細胞MCF-7、人乳腺癌細胞MCF-7R、人卵 巢癌細胞SK0V-3、人白血病細胞K562、人乳腺癌細胞MDA-MB-231、人類上皮癌細胞A431、人 類T細胞白血病細胞Jurkat E6-1、人回盲腸腺癌細胞HCT-8、人胚胎腎細胞HEK-293、人前 列腺癌細胞PC-3、人類T細胞淋巴瘤Hut-78、人結腸癌細胞LoVo、急性淋巴母細胞白血病細 胞Molt-4、人T淋巴瘤細胞Sup-Tl或人B細胞淋巴瘤細胞M〇2058。
[0048] 本發明首次發現核酸適配體Sgc_3b可以特異性識別并結合L選擇素，并利用核 酸適配體Sgc-3b與L選擇素的特異性結合作用建立了檢測L選擇素的方法。通過實驗證 明：本發明的核酸適配體Sgc-3b具有親和力高、特異性強、無免疫原性和無毒性等特點，基 于核酸適配體Sgc-3b建立的檢測L選擇素的方法可用于L選擇素表達的檢測和相關疾病 的診斷。
【附圖說明】
[0049] 圖1為Sgc-3b_Bio提取的L選擇素代表性的多肽的ESI-MS和MS/MS圖譜。圖IA 為重型同位素標記的[Μ+2ΗΓ離子ESI-MS譜圖；圖IB為輕型同位素標記的[M+2H] 2+離子 ESI-MS譜圖。圖IC為重型同位素標記的[Μ+2ΗΓ離子MS/MS譜圖；圖ID為輕型同位素標 記的[Μ+2ΗΓ離子MS/MS譜圖。其中，半胱氨基酸殘基被烷基化；K*表示重型同位素標記 的賴氨酸。
[0050] 圖2為Sgc-3b-FAM或anti-CD6