一種基于納米粒子標記氧化還原循環檢測多巴胺的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于電化學傳感器領域，具體涉及一種基于納米粒子標記氧化還原循環檢 測多巴胺的方法。
【背景技術】
[0002] 多巴胺是由下丘腦分泌主要負責大腦的情感信息傳遞，在醫學中多巴胺常用于治 療抑郁癥。人體中多巴胺含量不足，機體就會失去控制肌肉的本能，嚴重缺少會引起老年癡 呆、精神分裂癥、帕金森綜合征等。多巴胺的檢測多采用液相色譜儀分析，熒光標記分析， 高效液相色譜一質譜聯用，氣相色譜一質譜聯用等分析方法。由于這些方法需要大型的儀 器，具有操作費用昂貴等缺點，不能滿足快速簡便的檢測要求，需要建立簡便、快速的檢測 多巴胺的新方法。Feng等人利用4-氨基-3-肼基-5-巰基-1，2,4-三唑（AHMT)與金納米 粒子（AuNPs)鏈接制作探針（AHMT-AuNPs)，利用多巴胺與AHMT形成氫鍵促使AHMT-AuNPs 探針聚集，引起膠狀溶液的顏色變化實現了對多巴胺的測定（Feng J J，Guo H，Li Y F，et al.Single molecular functionalized gold nanoparticles for hydrogen-bonding recognition and colorimetric detection of dopamine with high sensitivity and selectivity [J]. ACS applied materials&interfaces，2013, 5(4) :1226-1231) 〇 Zhao 等將碳納米管修飾到電極表面，實現了對多巴胺和維生素 C的同時檢測（Zhao J，Zhang Wj Sherrell P，et al. Carbon nanotube nanoweb - bioelectrode for highly selective dopamine sensing[J] · ACS applied materials&interfaces，2011，4(I):44-48)〇 Hsu 等人將金納米線修飾到柔軟的對苯二甲酸乙二醇聚酯上制成薄膜覆蓋于電極上來進行 多巴胺的檢測（Hsu M S，Chen Y L，Lee C Y，et al. Gold nanostructures on flexible substrates as electrochemical dopamine sensors[J]. ACS applied materials&inter faces，2012, 4(10) :5570-5575)。Huang等將Au-Pt納米粒子修飾到碳納米纖維上來檢測多 巴胺的含量（Huang Y，Miao Y E，Ji Sj et al. Electrospun carbon nanofibers decorated with Ag - Pt bimetallic nanoparticles for selective detection of dopamine [J]. ACS applied materials&interfaces，2014, 6 (15) : 12449-12456) D 氧化石墨稀因含有駿 基、羥基、環氧基等官能團，并且具有靈活性、透光強、適宜大規模制備等特點，近年來在生 物傳感器方面被廣泛應用。BOTini小組利用氧化石墨烯的特性制備了可用于檢測濕度和溫 度的生物傳感器（Borini S，White R，Wei D，et al. Ultrafast graphene oxide humidity sensors [J]. ACS nano, 2013, 7(12) :11166-11173)。Li 小組則利用交流介電電泳制作了 基于氧化石墨稀的傳感器可高靈敏度的檢測含氮氧化物氣體（Li W，Geng X，Guo Y，et al. Reduced graphene oxide electrically contacted graphene sensor for highly sensitive nitric oxide detection[J]· ACS nano, 2011，5(9) :6955-6961) D 在本發明中， 首先，多巴胺適體互補序列與金鉑復合納米粒子作用形成探針，然后加入多巴胺適體，形成 雙鏈DNA修飾的金鉑復合納米粒子。當在雙鏈DNA修飾的金鉑復合納米粒子溶液中加入含 多巴胺樣品溶液時，多巴胺和多巴胺適體特異性結合，探針被釋放下來。然后，利用金納米 粒子和氧化石墨烯修飾的金電極捕獲釋放下來的探針，再利用金鉑復合納米粒子的催化作 用產生電化學信號實現多巴胺的檢測。
【發明內容】
[0003] 本發明旨在發明一種方法簡單、成本低、靈敏度高、選擇性高的測定多巴胺的方 法。
[0004] 實現發明目的技術方案是：
[0005] -種基于納米粒子標記氧化還原循環檢測多巴胺的方法。其原理是利用金鉑復合 納米粒子連接多巴胺適體互補序列單鏈DNA作為探針。再在上述探針中加入多巴胺適體， 形成雙鏈DNA修飾的金鉑復合納米粒子。當在雙鏈DNA修飾的金鉑復合納米粒子溶液中加 入含多巴胺的樣品溶液時，多巴胺和多巴胺適體特異性結合，探針被釋放下來。然后，利用 金納米粒子和氧化石墨稀修飾的金電極捕獲釋放下來的探針，再利用金鉬復合納米粒子的 催化作用產生電化學信號實現多巴胺的檢測。
[0006] 測定步驟為：
[0007] (1)納米粒子的制備
[0008] 首先，將氯鉑酸溶液和檸檬酸鈉溶液用0. 22 μ m微孔膜過濾。
[0009] 金納米粒子的制備：將質量分數為I. 0%的檸檬酸鈉溶液1.0 mL快速加入到沸騰 的濃度為〇. 3mmol/L的100.0 mL的氯金酸溶液中，在溶液保持沸騰狀態下攪拌lOmin，當溶 液變成酒紅色時，停止加熱，冷卻至室溫，得金納米粒子。
[0010] 金鉑復合納米粒子的制備：首先，將濃度為0. 03mol/L的1.0 mL的氯金酸溶液、 0.1 g的PVP和制備的IOmL的金納米粒子溶液置于盛放有50mL水的燒杯中，并混合均勻， 然后將其轉移到一個250mL燒瓶中加熱。將混合溶液加熱到沸騰并且保持沸騰狀態IOmin 后，在攪拌加熱的同時加入7. OmL質量分數為1. 0%的氯鉑酸溶液，隨后再緩慢加入一定體 積的抗壞血酸溶液，等到溶液變成黑棕色后停止加熱。然后再持續攪拌下將溶液冷卻至室 溫，得金鉑復合納米粒子。將ImL制備的金鉑復合納米粒子在14000轉/分鐘的條件下離 心lOmin，并用磷酸緩沖溶液洗滌三次，并分散于磷酸緩沖溶液。
[0011] (2)氧化石墨烯的制備
[0012] 首先，取質量分數為98 %的濃硫酸11. 5mL置于錐形瓶中，然后放于4°C的條件下 冷卻lh。將處理過的含有冷卻濃硫酸的錐形瓶放于冰水浴中，在磁力攪拌下，快速加入研磨 處理過的含0. 5g石墨粉和0. 25g硝酸鈉的混合物。反應5min后，分6次將共計I. 5g的高猛 酸鉀加入溶液中，在控制反應溫度在30-45Γ的條件下，攪拌反應2. 5h，溶液變成墨綠色。 然后將溫度控制在80-100°C之間，然后用滴液漏斗加入5mL去離子水，再繼續反應30min。 隨后用滴液漏斗將質量分數為5%的IOmL雙氧水緩慢加入，繼續攪拌lh，溶液逐漸變成土 黃色，再將溶液轉移到蒸發皿中在烘箱中烘干，然后再用去離子水將所得的固體溶解，將制 得的氧化石墨烯放于透析膜中進行透析，直到氧化石墨烯溶液呈中性為止，并烘干。
[0013] (3) DNA修飾納米粒子的制備
[0014] 將 20 μ L 的 pH 8. 2 的 50mmol/L 的 Tris-HCl、10 μ L 的 10mol/L 的 TCEP、10 μ L 的 1. OX 10 4mol/L的巰基乙胺以及20 μ L的1.0 X 10 6mol/L的DNAl加入到2mL的離心管中， 使用振動器使所得的溶液充分混合，然后放于搖床中，在37°C條件下反應一個小時。然后加 入洗滌過的金鉑復合納米粒子，并且在37°C條件下在搖床上孵育16h。隨后，將溶液離心并 用pH 7. 4的1.0 mL的0. lmol/L磷酸緩沖溶液沖洗三次，得DNAl修飾金鉑復合納米粒子探 針。
[0015] 然后加入1.0 X 10 6mol/L DNA2,在37°C條件下在搖床上孵育2h后離心分離，并用 pH 7. 4的1.0 mL的0. lmol/L磷酸緩沖溶液沖洗三次，并分散于1.0 mL磷酸緩沖溶液中，得 DNA修飾納米粒子，儲放于4 °C條件下。
[0016] (4)分析測定
[0017] 本發明所使用的電化學分析測定原理如在圖1所示。
[0018] 首先，將金電極表面經過打磨處理，依次滴加上IOyL的金納米粒子、10 μ L氧化 石墨稀，制得金納米粒子和氧化石墨稀修飾的金電極。
[0019] 將100 μ L含多巴胺的樣品溶液加入100 μ L的DNA修飾納米粒子溶液中，37 °C條 件下反應0. 5h后，離心分離，并用37°C條件下在搖床上孵育16h，并分散于50 μ L磷酸緩沖 溶液中，得多巴胺作用后的金鉑復合納米粒子探針。隨后將金納米粒子和氧化石墨烯修飾 的金電極插入反應〇. 5h后，用pH 7. 4的1.0 mL的0. lmol/L磷酸緩沖溶液沖洗電極表面三 次，將所得的電極作為工作電極，將其插入2mL含有0. 1~20mM對硝基苯酚，0. 1~20NaBH4 和0. 1~20mM的二茂鐵甲酸的pH 7. 4的磷酸緩沖溶液中，采用三電極系統測定電化學信 號。根據電化學響應信號與多巴胺的含量的關系實現多巴胺的測定。
[0020] 所述的高錳酸鉀，對硝基苯酚購于上海山浦化工有限公司。
[0021] 所述的巰基乙胺，巰基乙醇，氯金酸HAuCl4 · 3H20,氯鉑酸H2PtCl6 · 6H20均購自于 上海璞光試劑有限公司。
[0022] 所述的三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽TCEP購自于天津市紅巖化學試劑廠。
[0023] 所述的檸檬酸三納Na3C6H5O 7，二茂鐵甲酸FCA購自于國藥集團化學試劑有限公司。
[0024] 所述的石墨粉，多巴胺DA購買于上海阿拉丁試劑公司。
[0025] 所有使用的試劑都是化學純，所有的溶劑都用二次去離子水離子配置。
[0026] 將 21mL 0· 2mol/L 的 KH2P04、78mL 0· 2mol/L 的 Na2HPO4 · 12H20 混合，得到 0· Imol/ L pH為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液。