蛇膽川貝液的標準特征圖譜的構建及其質量檢測方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及中成藥的質量控制技術，具體涉及一種蛇膽川貝液的質量檢測方法。
【背景技術】
[0002] 蛇膽川貝液是一種上市多年的中成藥，有無糖型和有糖型兩種，現行執行標準是 國家藥品標準WS3-B-1832-94-2011。蛇膽川貝液是由原料蛇膽汁、平貝母和杏仁水經提取 精制配制而成，其具有祛風止咳、除痰散結功效，用于治療風熱咳嗽、痰多氣喘、胸悶、咳痰 不爽或久咳不止等。
[0003] 目前，對蛇膽川貝液的質量控制方法主要是蛇膽汁和平貝母藥材的薄層鑒別、以 及氫氰酸和牛磺膽酸的含量測定，該方法雖能在一定程度上控制蛇膽川貝液的質量，但還 是無法全面的反映其質量狀況，例如，蛇膽汁中所含有的活性成分很多，只用牛磺膽酸這個 指標來評價和控制產品的質量明顯不足。為了彌補現有蛇膽川貝液的質量控制方法的缺 陷，有必要構建該產品的標準特征圖譜，以便于更好地進行該產品的質量控制。
[0004] 經查閱資料可知，發明名稱為"一種利用特征圖譜控制牛黃蛇膽川貝膠囊里蛇膽 汁質量的方法（申請號為CN103149288A)的專利公開了一種牛黃蛇膽川貝膠囊里蛇膽汁特 征圖譜的檢測方法，其是以0. 4%甲醇和磷酸二氫鉀按7:3的體積比混合作為流動相、檢測 波長為205nm進行蛇膽汁的特征圖譜的檢測，牛黃蛇膽川貝膠囊公開的標準處方是由人工 牛黃、蛇膽汁和川貝母組成，具體制備方法是先將川貝母粉碎成細粉，然后與人工牛黃、蛇 膽汁混勾，最后干燥、粉碎、過篩、裝入膠囊，即得。經對比可知，牛黃蛇膽川貝膠囊與蛇膽川 貝液的處方組成以及制備方法完全不同，且所含活性成分也不同。申請人曾采用上述控制 牛黃蛇膽川貝膠囊里蛇膽汁質量的方法檢測蛇膽川貝液的特征圖譜，結果色譜峰較少，也 即是說直接采用上述方法無法實現對蛇膽川貝液的質量控制提供依據，因此，如何對蛇膽 川貝液的特征圖譜進行有效測定，進而為蛇膽川貝液的質量檢測控制提供依據，這是目前 尚需解決的技術瓶頸。
[0005] 發明目的
[0006] 本發明的首要目的是提供一種操作方便、重現性好、精密度高的蛇膽川貝液的標 準特征圖譜的構建方法。
[0007] 為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種蛇膽川貝液的標準特征圖譜 的構建方法，其步驟如下：
[0008] a)標樣溶液、參照物溶液的準備：將至少20批次合格的蛇膽川貝液分別浸提得到 各標樣溶液，將牛黃膽酸鈉對照品加甲醇制成參照物溶液；
[0009] b)高效液相色譜分析：精密吸取等量的各標樣溶液、參照物溶液，分別注入液相 色譜儀進行測定，即得各標樣溶液和參照物溶液的色譜圖；
[0010] c)標準特征圖譜的構建：將得到的各標樣溶液的色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜 相似度評價系統，制定得到蛇膽川貝液的標準特征圖譜。該標準特征圖譜中有8個特征峰， 按出現的時間順序將所述的8個特征峰依次編號1~3、S、4~7,以參照物溶液的色譜峰的 相對保留時間為1，計算得知1~7號特征峰的平均相對保留時間分別為0. 52、0. 86、0. 91、 I. 10、I. 21、I. 76、I. 93 ;所述的S號色譜峰是牛黃膽酸鈉的特征峰，其平均相對保留時間為 1〇
[0011] 本發明公開的蛇膽川貝液的標準特征圖譜的構建方法是申請人經多年的試驗研 究獲得，其完善、科學，采用該方法構建的標準特征圖譜中的8個特征峰的分離度高，為后 續蛇膽川貝液產品的質量檢測有效地提供了數據基礎，進而為蛇膽川貝液今后的標準化生 產提供一種可行的質量控制模式。具體說來，本發明是將合格的各蛇膽川貝液制得的標樣 溶液與牛黃膽酸鈉對照品制得的參照物溶液在規定的實驗條件下測定分析得到色譜圖，這 樣將牛黃膽酸鈉對照品的色譜圖與合格的各蛇膽川貝液的色譜圖進行比對，從而可以確定 兩者之間的共有特征峰，亦即找出各蛇膽川貝液測得的色譜圖上的牛黃膽酸鈉的特征峰， 從而以牛黃膽酸鈉特征峰的相對保留時間為1，計算出各蛇膽川貝液的色譜圖上其他特征 峰的相對保留時間，進而為后續的待測蛇膽川貝液產品的質量檢測提供數據基礎。
[0012] 上述記載的合格的蛇膽川貝液也可以理解為是標準蛇膽川貝液，其是質量完全符 合國家相關標準的蛇膽川貝液。
[0013] 具體的方案為，高效液相色譜分析的色譜條件為：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合 硅膠為填充劑（柱長為250mm，內徑為4. 6mm,粒徑5 μ m);以甲醇為流動相A，以0· 04~ 0. 4%的磷酸二氫鉀溶液為流動相B，流動相按體積比為30~56 :70~44的A相和B相梯 度洗脫，所述的磷酸二氫鉀溶液用磷酸調至PH值為3. 0 ;流速0. 5~I. 5ml/min ;檢測波長 205±2nm ;柱溫30~40°C ;進樣液的進樣量為10-20 μ 1 ;按照牛黃膽酸鈉峰計算，理論塔 板數彡7000。
[0014] 作為進一步的優選方案，所述的A相為色譜級甲醇；梯度洗脫的時間及流動相比 例為：0 ~lOmin，A 相 30%- 35%，B 相 70%- 65% ;10 ~20min，A 相 35%- 56%，B 相 65%- 44% ;20 ~60min，A 相 56%，B 相 44%。
[0015] 實際在制備標樣溶液和參照物溶液時，優選方案是取20批合格的蛇膽川貝液分 別進行浸提操作，蛇膽川貝液的浸提步驟為：向蛇膽川貝液中加8~10倍體積的40%~ 50%甲醇，稀釋，搖勻，室溫靜置10~30分鐘，濾過，取續濾液即為標樣溶液；優選的，取20 批合格的蛇膽川貝液分別進行浸提操作，蛇膽川貝液的浸提步驟為：向蛇膽川貝液中加9 倍體積的50%甲醇，稀釋，搖勻，室溫靜置20分鐘，濾過，取續濾液即為標樣溶液；具體的浸 提操作為：精密吸取蛇膽川貝液lml，置IOml量瓶中，加40% -50%甲醇稀釋至刻度，搖勻， 室溫靜置10-30分鐘，濾過，取續濾液即為標樣溶液。按上述限定參數進行操作制取的標樣 溶液中各組分的分離效果最好，測得的蛇膽川貝液的色譜圖也最為準確。
[0016] 另外，參照物溶液的制備步驟為：取牛磺膽酸鈉對照品，加甲醇制成每1ml含 0.1 mg~0. 5mg的溶液，濾過，取續濾液即為參照物溶液；優選的，參照物溶液的制備步驟 為：取牛磺膽酸鈉對照品，加甲醇制成每1ml含0. 3mg的溶液，濾過，取續濾液即為參照物溶 液。
[0017] 本發明的另一個目的是基于以上方法構建的蛇膽川貝液的標準特征圖譜，提供一 種蛇膽川貝液的質量檢測方法。
[0018] 為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為，一種蛇膽川貝液的質量檢測方法， 其步驟如下：按照標樣溶液和參照物溶液的方法制備并測定得到待測蛇膽川貝液的色譜圖 和對照品牛黃膽酸鈉的色譜圖，將待測蛇膽川貝液的色譜圖與構建的標準特征圖譜比對， 若待測蛇膽川貝液的色譜圖中出現標準特征圖譜中相同的8個特征峰，與參照物峰相應的 峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間。各特征峰的相對保留時間與標準特征圖 譜中各特征峰的相對保留時間的相對標準偏差在±5%以內，則該蛇膽川貝液的質量合格， 反之則不合格，如此可以實現快速檢測判斷蛇膽川貝液的質量。
【附圖說明】
[0019] 圖1為實施例1測得的牛黃膽酸鈉的色譜圖；
[0020] 圖2為實施例1測得的標準蛇膽川貝液的色譜圖；
[0021] 圖3為實施例1中測得的20批標準蛇膽川貝液的色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜 相似度評價系統中進行分析導出的截圖；
[0022] 圖4為實施例1制定得到的蛇膽川貝液的標準特征圖譜。
【具體實施方式】
[0023] 以下結合實施例1-3對本發明公開的技術方案作進一步的說明：
[0024] 實施例1 :蛇膽川貝液的標準特征圖譜的構建
[0025] 1、儀器與藥品
[0026] 儀器：Waters高效液相色譜儀，2489檢測器。
[0027] 藥品：磷酸（分析純）；甲醇（色譜級，SIGAMA) ;20批標準蛇膽川貝液（無糖型）由 安徽安科余良卿藥業有限公司提供，批號分別為20140305、20140408、20140603、20140708、 20140803、20140902、20140906、20141202、20150107、20150112、20150116、20150202、 20150304、20150307、20150313、20150317、20150320、20150322、20150408、20150503,上述 20批標準蛇膽川貝液依次編號為Sl~S20 ;牛磺膽酸鈉對照品（純度88. 9% )，批號為 110815-200506。
[0028] 2、色譜條件
[0029] 色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（柱長為250mm，內徑為4. 6mm,粒徑 5 y m);以甲醇為流動相A，以0. 4%的磷酸二氫鉀溶液為流動相B，流動相按體積比為30~ 56 :70~44的A相和B相梯度洗脫，所述的磷酸二氫鉀溶液用磷酸調至pH值為3. 0,梯度 洗脫的時間及流動相比例為：0~1011^11，4相30%-35%，8相70%-65% ;10~201^11， A 相 35%- 56%，B 相 65%- 44% ;20 ~60min，A 相 56%，B 相 44% ;流速 1.0 ml/min ;檢 測波長205nm ;柱溫30~40°C ;進樣液的進樣量為10 μ 1 ;按照牛黃膽酸鈉峰計算，理論塔 板數彡7000。
[0030] 3、標準特征圖譜的特征峰的測定
[0031] 3. 1標準特征圖譜的構建
[0032] (1)標樣溶液的制備：精密吸取20批標準蛇膽川貝液（無糖型）各1ml，分別置 IOml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，室溫靜置20分鐘，濾過，取續濾液即得20個標 樣溶液。
[0033] (2)參照物溶液的制備：取牛磺膽酸鈉對照品50mg，置100mL量瓶中，加甲醇稀釋 至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為參照物溶液。
[0034] (3)高效液相色譜分析：分別精密吸取參照物溶液和標樣溶液各10 μ 1，分別注入 液相色譜儀中進行測定，記錄60分鐘的圖譜，即得牛黃膽酸鈉對照品的色譜圖（見圖1)和 標準蛇膽川貝液的色譜圖（見圖2,批號為20150503的無糖型標準蛇膽川貝液的色譜圖）。
[0035] (4)標準特征圖譜的構建
[0036] 將檢測得到的20批標準蛇膽川貝液（無糖型）的色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜 相似度評價系統，相應操作后得到如圖3所示的標準蛇膽川貝液的特征圖譜，圖3中的R號 圖譜為系統生成的對照圖譜，導出即得如圖4所示的標準蛇膽川貝液的標準特征圖譜。
[0037] 3. 2標準特征圖譜中特征峰的確定
[0038] 經比較20批標準蛇膽川貝液（無糖型）色譜圖和牛黃膽酸鈉的色譜圖，確定蛇 膽川貝液的色譜圖中有8個特征峰，按出現的時間順序將這8個特征峰依次編號1~3、S、 4~7,其中S號色譜峰為牛黃膽酸鈉的特征峰，設定S號峰的相對保留時間為1，計算其他 7個峰的相對保留時間，結果如表1所示。經計算，1~7號峰的平均相對保留時間分別為： 0· 52、0· 86、0· 91、1· 10、1· 21、1· 76、1· 93,相對標準差均彡 0· 5