一種基于光誘導介電泳技術的細胞分類方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及細胞分類領域，尤其涉及一種基于光誘導介電泳技術的細胞分類方 法。
【背景技術】
[0002] 現有技術中，細胞分類主要是以下幾種方法：
[0003] 1、離心法：離心法分類是利用不同尺寸和密度的細胞在離心場中沉降行為的不 同，從組織勻漿或血液中將不同細胞分類的技術。用離心技術分離細胞主要依賴的方法是 差分離心、速率一區帶密度梯度離心、等密度離心和利用特殊轉頭的細胞浮選離心。
[0004] 2、膜濾法：用半透膜作為選擇障礙層，利用膜的選擇性（孔徑大小），以膜的兩側 存在的能量差作為推動力，允許某些特定類型的細胞透過而保留其他類型細胞，從而達到 分離目的細胞分類技術。
[0005] 3、熒光激活細胞分類術：即以熒光素標記抗體結合相應細胞，用激光束激發單行 流動的細胞，根據細胞所攜帶的熒光對細胞進行自動分析或分選。其原理是：被熒光染色的 細胞在激光束的照射下，產生散射光和激發熒光。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種 信號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經過一系列雙色 性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。
[0006] 但上述方法均存在不足之處：
[0007] 離心法：成本太高，耗時太久，需要制備介質溶液，操作嚴格，不易控制。
[0008] 膜濾法：薄膜的制備過于復雜，不同薄膜對于實驗環境的要求不同，薄膜的使用壽 命有限。
[0009] 熒光激活細胞分類術：成本太高，另外存在細胞內低豐度分子難以檢測，缺少"通 用"細胞通透物質，細胞自發熒光的干擾效應，熒光分子間發射光譜的重疊，以及缺少可識 別目標分子的試劑。特別是對于細胞分揀來說，由于液滴的形成收集、分揀細胞重分析或培 養前的稀釋，以及為獲得足夠數量的可用細胞需要的時間延誤的原因，還存在細胞存活問 題。最后，特別是在處理低豐度對象時，數據分析難以處理。
[0010] 因此，現有技術還有待于改進和發展。
【發明內容】
[0011] 鑒于上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種基于光誘導介電泳技術的 細胞分類方法，旨在解決現有細胞分類方法成本高、操作復雜、效率低、準確率低等問題。
[0012] 本發明的技術方案如下：
[0013] -種基于光誘導介電泳技術的細胞分類方法，其中，包括步驟：
[0014] A、制作光誘導介電泳芯片，所述光誘導介電泳芯片有三層結構組成：下層為涂有 氫化非晶硅涂層的ITO玻璃，上層是不含涂層的ITO玻璃，在上下兩層ITO玻璃之間封裝有 一個微流體通道，用于注射所需操作的溶液；
[0015] B、向上下兩層ITO玻璃的電極輸入可變頻率的交流信號，同時利用入射光照射所 述光誘導介電泳芯片，從而在被照射的區域產生非均勻電場；
[0016] C、改變交流信號的頻率及大小，以控制細胞運動方向，同時采集細胞的圖像；
[0017] D、根據采集的圖像對待分類細胞的位移和時間進行擬合，然后根據擬合結果使用 已訓練的支持向量機來進行分類，得到細胞類型。
[0018] 所述的基于光誘導介電泳技術的細胞分類方法，其中，所述步驟A中，制作光誘導 介電泳芯片的步驟具體包括：
[0019] AU清理ITO玻璃基質；
[0020] A2、在ITO玻璃基質上沉積氫化非晶硅涂層；
[0021] A3、在氫化非晶硅涂層上涂光刻膠；
[0022] A4、在光刻膠上進行板印；
[0023] A5、接觸腐蝕至ITO玻璃基質；
[0024] A6、去除光刻膠；
[0025] A7、在ITO玻璃基質上未覆蓋氫化非晶硅涂層的區域涂導電粘合劑。
[0026] 所述的基于光誘導介電泳技術的細胞分類方法，其中，所述細胞在非均勻電場中 的所受到的平均介電泳力用如下公式描述：
[0028] 其中Fdep是作用到細胞上的平均介電泳力，R是細胞的半徑，ε $細胞所在溶液 的介電常數，Ems為所施加交流信號的均方根值，f eM為Clausius-Mossotti因子，在計算平 均介電泳力時取該因子的實部Re [fCM]。
[0029] 所述的基于光誘導介電泳技術的細胞分類方法，其中，feM因子定義如下：
[0031] ￡療和εη*分別是細胞和溶液的復介電常數。
[0032] 所述的基于光誘導介電泳技術的細胞分類方法，其中，所述復介電常數表示為：
[0034] 其中，ε是溶液的介電常數，σ是導電率，ω是所施加交流信號的頻率。
[0035] 所述的基于光誘導介電泳技術的細胞分類方法，其中，細胞旋轉速度為：
[0037] 其中E是電場強度，η是溶液的黏稠度，頂[fCM]是Clausius-Mossotti因子的虛 部，K為系數。
[0038] 所述的基于光誘導介電泳技術的細胞分類方法，其中，細胞在平均介電泳力下的 位移公式如下：
[0039]
U。是細胞在平均介電泳力下的初速度，τ是時間常數。
[0040] 有益效果：本發明的細胞分類方法，其成本低，操作簡單，整個分類過程基本上是 自動化的，只需把培養好的細胞放入容器中，即可自動分類，由于分類過程的自動化，所以 可在很短的時間內完成大量細胞的分類，效率較高。另外本發明的方法準確率高，在現有條 件下能夠達到97. 5%的準確率。
【附圖說明】
[0041] 圖1為本發明一種基于光誘導介電泳技術的細胞分類方法較佳實施例的流程圖。
[0042] 圖2為本發明中的光誘導介電泳平臺的結構示意圖。
【具體實施方式】
[0043] 本發明提供一種基于光誘導介電泳技術的細胞分類方法，為使本發明的目的、技 術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具 體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0044] 請參閱圖1，圖1為本發明一種基于光誘導介電泳技術的細胞分類方法較佳實施 例的流程圖，如圖所示，其包括步驟：
[0045] S100、制作光誘導介電泳芯片（0DEP芯片），所述光誘導介電泳芯片有三層結構組 成：下層為涂有氫化非晶硅涂層的ITO玻璃，上層是不含涂層的ITO玻璃（即不含氫化非晶 硅涂層），在上下兩層ITO玻璃之間封裝有一個微流體通道，用于注射所需操作的溶液；
[0046] S200、向上下兩層ITO玻璃的電極輸入可變頻率的交流信號，同時利用入射光照 射所述光誘導介電泳芯片，從而在被照射的區域產生非均勻電場；可先向微流體通道注入 細胞和介質（介質即所需操作的溶液，也即細胞所在溶液）。然后輸入交流信號。
[0047] S300、改變交流信號的頻率及大小，以控制細胞運動方向，同時采集細胞的圖像；
[0048] S400、根據采集的圖像對待分類細胞的位移和時間進行擬合，然后根據擬合結果 使用已訓練的支持向量機來進行分類，得到細胞類型。
[0049] 進一步，所述的步驟SlOO中，制作光誘導介電泳芯片的步驟具體包括：
[0050] S101、清理ITO玻璃基質；
[0051] 清理ITO玻璃基質的表面，保證接觸面的潔凈度。
[0052] S102、在ITO玻璃基質上沉積氫化非晶硅涂層（a-Si :H);
[0053] 在ITO玻璃基質表面沉積一層氫化非晶硅，厚度為1微米。
[0054] S103、在氫化非晶硅涂層上涂光刻膠；
[0055] S104、在光刻膠上進行板印；
[0056] 板印是按照指定圖形制作遮蓋物，將遮蓋物放在光刻膠表面，用紫外線照射遮蓋 物，沒有被遮蓋的光刻膠在紫外線作用下溶解，最終得到與遮蓋物形狀相同的光刻膠層。
[0057] S105、接觸腐蝕至ITO玻璃基質；具體是用草酸腐蝕制作的芯片表層，以去除沒有 覆蓋光刻膠的氫化非晶硅涂層。
[0058] S106、去除光刻膠；即將光刻膠從氫化非晶硅涂層表面去除。
[0059] S107、在ITO玻璃基質上未覆蓋氫化非晶硅涂層的區域涂導電粘合劑。即在ITO 玻璃的表面沒有覆蓋氫化非晶硅涂層的位置添加一個導電觸點。
[0060] 而上層的ITO玻璃清理干凈之后，涂導電粘合劑即可。
[0061] 在上下兩層ITO玻璃之間封裝有一個微流體通道（100微米高），，具體是通過 PDMS或是雙面膠封裝出一個微流體通道。
[0062] 在步驟S200中，如圖2所示，首先搭建光誘導介電泳平臺。除了步驟SlOO制作的 ODEP芯片20,平臺還需要一臺光學顯微鏡10、一臺光學投影儀（高分辨率）、一個可編程信 號發生電路和主機系統。所述主機系統包括：圖像采集模塊、顯微視覺算法處理模塊、生物 芯片驅動控制器、虛擬電極生成模塊以及顯示輸出模塊。所述圖像采集模塊用來采集光學 顯微鏡20的圖像，并交由顯微視覺算法處理模塊來進行處理并通過顯示輸出模塊來顯示， 所述顯微視覺算法處理模塊還向生物芯片驅動控制器及虛擬電極生成模塊發出信號用來 控制二者工作。所述生物芯片驅動控制器連接所述可編程信號發生電路來改變交流信號頻 率和大小。所述可編程信號發生電路通過電極連接所述ODEP芯片20。所述光學投影儀設 置在ODEP芯片20下方，用來對其進行入射光照射。所述虛擬電極生成模塊連接所述光學 投影儀。
[0063] 其中光學顯微鏡參數如下：
[0064] 尼康CFI60無限遠光學系統；
[0065] 電動對焦，可上下移動（上13mm/下2mm);
[0066] 三目鏡筒，光分布：目鏡/相機100%/0, 20%/100%，0/100% ;
[0067] 目鏡放大倍率：IOx;
[0068] 聚光器：防水，工作距離：7. 2mm ;
[0069] 物鏡：20x，高度消色透鏡，納米結晶涂層；
[0070] 載物臺：電動X軸和Y軸，分辨率：0. 1微米；
[0071] 紫外線截止濾光塊；
[0072] 熒光濾波套裝：FITC/GFP。
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