一種可用于減緩單分子熒光漂白現象的除氧試劑及其應用方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及單分子熒光檢測技術領域，尤其涉及一種可用于減緩單分子熒光漂白 現象的除氧試劑及其應用方法。
【背景技術】
[0002] 單分子熒光檢測是近年來迅速發展起來的一種超靈敏的檢測技術，自從1976年 Hirschfeld第一次嘗試用全內反射熒光法實現以來，單分子熒光檢測技術逐漸在化學分 析、DNA測序、醫學診斷、分子動力學等領域發揮著重要作用。
[0003] 然而單分子熒光在檢測過程中由于受激發光的照射，存在光漂白淬滅效應。光漂 白會導致檢測時長和檢測到的總光子數減少。對單個單分子而言，發射出的總光子數決定 了單分子熒光的信噪比，發光的時長決定了樣品可檢測時長。以基因測序為例，單分子熒光 可檢測時長決定了 DNA測序的讀度，因此減緩單分子熒光漂白，增加樣品的可檢測時長有 重要意義。
[0004] 研究表明，氧分子是單分子熒光發生漂白的主要原因，它導致單分子熒光漂白的 方式有兩種：一是直接與激活狀態的熒光分子發生化學反應，二是通過產生自由基間接地 反應。為減緩單分子熒光漂白，必須盡可能地降低溶液中氧分子和氧自由基濃度。常用的 除去溶液中氧分子和氧自由基的方法有以下兩種：一種是在溶液中加入適當濃度的還原劑 去除氧分子的化學方法，但還原劑與氧分子的反應容易引起溶液中PH值的改變；另一種通 過加入去氧酶試劑的生物方法，但是體系中溫度、pH值、離子濃度均對酶活性都影響較大， 使用有較大的局限性。
【發明內容】
[0005] 為解決上述問題，本發明提供了一種操作簡單、效果顯著的減緩單分子熒光漂白 現象的除氧試劑及其應用方法，可以有效增加單分子檢測時長。
[0006] 第一方面，本發明提供了一種可用于減緩單分子熒光漂白現象的除氧試劑，所述 除氧試劑包括的各組分及其體積份數為：pH = 7. 1-9. 0、濃度為20-400mM的Tris-HCl緩沖 液74-86份，濃度為50-300mM的抗壞血酸鈉溶液8-12份，濃度為20-200mM的酪氨酸溶液 2-6份，濃度為5-50mM的還原谷胱甘肽溶液4-8份。
[0007] 優選地，所述除氧試劑包括的各組分及其體積份數為：pH = 7. 1-9.0、濃度為 20-400mM的Tris-HCl緩沖液81份，濃度為50-300mM的抗壞血酸鈉溶液10份，濃度為 20-200mM的酪氨酸溶液4份，濃度為5-50mM的還原谷胱甘肽溶液5份。
[0008] 更優選地，所述除氧試劑包括的各組分及其體積份數為：pH = 8、濃度為IOOmM的 Tris-HCl緩沖液81份，濃度為200mM的抗壞血酸鈉溶液10份，濃度為50mM的酪氨酸溶液 4份，濃度為50mM的還原谷胱甘肽溶液5份。
[0009] 優選地，所述抗壞血酸鈉溶液是pH = 7. 1-9. 0、濃度為20-400mM的Tris-HCl緩沖 液作為溶劑配制而成。
[0010] 進一步優選地，所述抗壞血酸鈉溶液是pH = 8、濃度為20-400mM的TriS-HCl緩沖 液作為溶劑配制而成。
[0011] 更優選地，所述抗壞血酸鈉溶液是pH = 8、濃度為IOOmM的TriS-HCl緩沖液作為 溶劑配制而成。
[0012] 優選地，所述酪氨酸溶液、所述還原谷胱甘肽溶液是采用雙蒸水作為溶劑配制而 成。
[0013] 如本發明所述，如無特殊說明，上述化學品均指市售藥品。
[0014] 如本發明所述的，所述各溶液的濃度均是指在混合前，各溶液自身的物質的量濃 度。
[0015] 本發明中，所述pH = 8、濃度為50mM的Tris-HCl緩沖液是采用如下方法配制：將 50mL、0.1 M的三羥甲基氨基甲烷（Tris)溶液與29. 2mL的0.1 M的鹽酸混勻后，加水稀釋至 IOOmL0
[0016] IUpH = 8、濃度為0.1 M的Tris-HCl緩沖液：稱量12. Ilg的三羥甲基氨基甲烷， 加入700mL雙蒸水，攪拌溶解。并加入IM的濃鹽酸調節pH，并實時觀察溫度穩定在25°C， 調節pH值至8. 0,轉入IL容量瓶，定容至1L。
[0017] 本方法中提供的可用于減緩單分子熒光漂白的除氧試劑中，Tris-HCl緩沖液可以 有效地穩定了溶液環境中的PH值；抗壞血酸鈉、酪氨酸都是比較溫和的還原劑，還原谷胱 甘肽能很好的除去溶液中的氧分子和氧自由基，所述除氧試劑的各組分之間是協同的統一 整體，各個組分缺一不可，且各個組分的含量既不是越多越好，也不是越少也好，本申請通 過調整除氧試劑中各組分的濃度及其比例，既可以有效除去溶液中氧分子和氧自由基，又 不會引起體系PH值的變化。可以將所述除氧試劑用于單分子熒光檢測領域，減緩單分子熒 光漂白現象，有效增加單分子檢測時長，提高檢測準確度和靈敏度。
[0018] 第二方面，本發明還提供了一種可用于減緩單分子熒光漂白現象的除氧試劑的應 用方法，包括如下步驟：
[0019] (1)分別配制pH = 7. 1-9. 0、濃度為20-400mM的Tris-HCl緩沖液，濃度為 50-300mM的抗壞血酸鈉溶液，濃度為20-200mM的酪氨酸溶液，濃度為5-50mM的還原谷胱甘 肽溶液；
[0020] (2)取體積份數如下的上述各組分：pH = 7. 1-9. 0、濃度為20-400mM的Tris-HCl 緩沖液74-86份，濃度為50-300mM的抗壞血酸鈉溶液8-12份，濃度為20-200mM的酪氨酸 溶液2-6份，濃度為5-50mM的還原谷胱甘肽溶液4-8份；
[0021] 將上述各組分混合均勻，得到可用于減緩單分子熒光漂白現象的除氧試劑；
[0022] (3)將所述除氧試劑栗入裝有待測單分子熒光物質的單分子熒光檢測體系的腔 室，進行單分子熒光檢測。
[0023] 優選地，步驟（1)中，所述抗壞血酸鈉溶液是采用pH = 7. 1-9. 0、濃度為20-400mM 的Tris-HCl緩沖液作為溶劑配制而成。
[0024] 更優選地，所述抗壞血酸鈉溶液是pH = 8、濃度為20-400mM的Tris-HCl緩沖液作 為溶劑配制而成。
[0025] 優選地，步驟（1)中，所述酪氨酸溶液、所述還原谷胱甘肽溶液是采用雙蒸水作為 溶劑配制而成。
[0026] 優選地，步驟⑵中，所述除氧試劑包括的各組分及其體積份數為：pH = 7. 1-9. 0、 濃度為20-400mM的Tris-HCl緩沖液81份，濃度為50-300mM的抗壞血酸鈉溶液10份，濃 度為20-200mM的酪氨酸溶液4份，濃度為5-50mM的還原谷胱甘肽溶液5份。
[0027] 更優選地，步驟（2)中，所述除氧試劑包括的各組分及其體積份數為：pH = 8、濃度 為IOOmM的Tris-HCl緩沖液81份，濃度為200mM的抗壞血酸鈉溶液10份，濃度為50mM的 酪氨酸溶液4份，濃度為50mM的還原谷胱甘肽溶液5份。
[0028] 優選地，步驟（3)中，所述待測單分子熒光物質包括單分子熒光染料或單分子熒 光染料標記的蛋白質、DNA。
[0029] 優選地，所述單分子焚光染料包括花菁染料Cyanine 3(簡稱Cy3)、Cyanine 5(簡 稱Cy5)和Atto 610中的一種或多種，但不限于此，常用的單分子熒光染料均包含在內。
[0030] 所述Cy3、Cy5和Atto 610的結構式如下：
[0032] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0033] (1)本發明提供的除氧試劑的配比簡單，成本低，所述除氧試劑可有效除去溶液中 氧分子和氧自由基；
[0034] (2)所述可用于減緩單分子熒光漂白的除氧試劑的應用方法簡單，操作性強，處理 時間短，由于采用了所述除氧試劑，可以有效減緩單分子熒光漂白反應，增加了單分子檢測 時長。
【附圖說明】
[0035] 圖1是本發明實施例1制得的除氧試劑及對比實施例1、2的除氧試劑減緩花菁染 料Cy3的單分子熒光漂白效果圖；
[0036] 圖2是考察放置時間對本發明實施例1制得的除氧試劑對減緩Cy3的單分子熒光 漂白效果圖。
【具體實施方式】
[0037] 為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，下面結合 附圖與較佳實施例，對本發明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用 以解釋本發明，不用于限定本發明。
[0038] 實施例1 :
[0039] -種可用于減緩單分子熒光漂白現象的除氧試劑的應用方法，包括如下步驟：
[0040] (1)配制pH = 8、濃度為IOOmM的Tris-HCl緩沖液，并用上述Tris-HCl緩沖液作 為溶劑配制濃度為50-300mM的抗壞血酸鈉溶液，并用雙蒸水分別配制濃度為50mM的酪氨 酸溶液、濃度為50mM的還原谷胱甘肽溶液；
[0041] (2)取如下體積份數的上述各組分：pH = 8、濃度為IOOmM的Tris-HCl緩沖液81 份，濃度為200mM的抗壞血酸鈉溶液10份，濃度為50mM的酪氨酸溶液4份，濃度為50mM的 還原谷胱甘肽溶液5份；
[0042] 將上述各組分混合均勻，得到可用于減緩單分子熒光漂白現象的除氧試劑；
[0043] (3)將帶標記有Cy3單分子熒光染料的DNA固定在玻璃片上，然后將固定有Cy3的 玻璃片放到帶墊片的槽上組裝成一個小腔室，即流通池，然后將所述除氧試劑栗入這個腔 室，并進行Cy3的單分子熒光檢測。
[0044] 本實施例中，將帶標記有Cy3單分子熒光染料的DNA固定在玻璃片，具體是：將3' 端連有cy3、5'端連接有順2的DNA分子與表面修飾上-COOH的玻璃片通過交聯劑固定在 一起。
[0045] 對比實施例1-