檢測重組蛋白表達情況的試劑盒及其使用方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程技術領域，用于檢測重組抗原表達水平，尤其是涉及一種檢測重組蛋白表達情況的試劑盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002]DNA重組技術是現代生物學發展的一個重要分支，是分子生物學發展的突出領域，極大地促進了生命科學領域研究及應用的進步。其中，將某種目的蛋白的基因構建在表達載體上，利用某種生物細菌或細胞來大量表達目的蛋白，也就是重組蛋白的表達是DNA重組技術的重要應用之一。重組蛋白表達技術的出現使得人們可以利用基因工程的手段生產所需要的氨基酸序列(蛋白質)，進而大量獲得過去難以獲得的生物體內、外的蛋白質，同時也是研究蛋白質功能結構，以及篩選靶向藥物的有力工具，在基礎科學以及醫藥學領域發揮了重要作用。
[0003]目前重組蛋白表達系統有許多，根據表達蛋白的宿主的不同可以分為原核表達系統、真核表達系統。不同的表達系統有各自的優缺點，通常根據目的蛋白的性質和后續的應用進行選擇。原核表達系統是利用特定的大腸桿菌工程菌株作為宿主菌來表達外源重組蛋白的一個系統，由于其遺傳背景清楚，培養操作簡單、轉化效率高、生長繁殖快、成本低廉，且可以快速大規模地生產目的蛋白等優點而被廣泛地用于外源蛋白的表達。目前，多數表達載體常帶有His標簽，主要是在表達后蛋白純化中發揮作用。從本質上說，His標簽是一種親和性標簽，與IMAC (固定化金屬螯合親和層析)親和，使目的蛋白的純化過程變的更加程序化，更具可控性。
[0004]重組蛋白表達量受多種因素的影響，如誘導表達時間、培養溫度、IPTG濃度等。重組蛋白表達量的多少對后續工作非常關鍵。因此，建立一種快速定量檢測重組蛋白表達量的方法有利于提高工作效率和準確性。目前檢測重組蛋白的方法主要是聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡試驗(western-blot)。而SDS-PAGE只能對重組蛋白表達量的相對多少進行估算，不能準確定量，而且需要一定的表達量才能肉眼識別出來。免疫印跡試驗是將電泳分離后蛋白質條帶轉移到硝酸纖維膜上，再利用抗原與相應的抗體進行免疫反應后，通過相應的顯色反應，以檢測相應目的蛋白的表達量。上述重組蛋白方法比較耗時，操作繁瑣，不適合應用于大批量檢測。另外，利用重組熒光素酶和綠色熒光蛋白來檢測重組蛋白表達量也較常見。綠色焚光蛋白(green fluorescent protein)，簡稱GFP，這種蛋白質最早是由下村修等人在1962年在一種學名Aequorea victoria的水母中發現。其基因所產生的蛋白質，在藍色波長范圍的光線激發下，會發出綠色螢光，以此來檢測重組蛋白，這個發光的過程中還需要冷光蛋白質Aequorin的幫助，且這個冷光蛋白質與鈣離子(Ca2+)可產生交互作用。熒光素酶(Luciferase)是自然界中能夠產生生物螢光的酶的統稱，在相應化學反應中，螢光的產生是來自于熒光素的氧化，有些情況下反應體系中也包括三磷酸腺苷(ATP) ο這兩種方法成本較高、不穩定、不能準確定量，而且容易覆蓋下游小分子目的蛋白，降低檢測準確性，甚至影響重組蛋白的生物學活性。
【發明內容】
[0005]有鑒于此，本發明旨在提出一種檢測重組蛋白表達情況的試劑盒及其使用方法，以實現快速定量檢測目的蛋白的目的。
[0006]為達到上述目的，本發明創造的技術方案是這樣實現的:
[0007]一種檢測重組蛋白表達情況的試劑盒，包括偶聯抗His-標簽抗體的受體微球、生物素標記的針對目的蛋白的多克隆抗體、親和素標記的供體球；優選的，還包括生物素化抗體稀釋液、受體微球稀釋液。所述生物素標記的多克隆抗體，針對目的蛋白抗體。
[0008]優選的，還包括發光反應板，優選的，所述發光反應板為96孔發光檢測板。
[0009]本發明還提供了使用如上所述的檢測重組蛋白表達情況的試劑盒進行檢測的方法，包括如下操作步驟，
[0010]I)將誘導表達后的大腸桿菌進行超聲破碎，即得到帶有His標簽目的蛋白的破碎菌液(待檢樣本)；
[0011 ] 2)將偶聯抗His-標簽抗體的受體球溶液、帶有His標簽目的蛋白的破碎菌液、生物素標記的抗目的蛋白的多克隆抗體溶液加入發光反應板混合，做2?4個復孔，在37°C下溫育0.5?1.5小時，優選的，溫育I小時；同時進行陰性對照，所述陰性對照的操作是將偶聯抗His-標簽抗體的受體球溶液、未誘導表達的超聲破碎菌液、生物素標記的抗目的蛋白的多克隆抗體溶液加入發光反應板混合，做2?4復孔，溫育溫度以及時間與帶有His標簽目的蛋白的破碎菌液的溫育相同；
[0012]3)在避光條件下，向每個孔加入親和素標記的供體球溶液，在37°C下溫育10?20min ;優選的，15min ；
[0013]4)讀數，結果判定；如待檢測菌液的信號值多2陰性對照的信號值，則判定有重組蛋白的大量表達，并且，信號值越大，表達量水平越高；優選的，用光激發發光檢測儀在615nm下檢測光信號。
[0014]本發明采用目前最先進的基于活性氧激發能量轉移的均相發光免疫分析系統，即基于抗原抗體特異性結合和生物素-親和素放大系統來檢測重組蛋白表達量。將受體球-His-tag Ab (偶聯抗His-標簽抗體的受體球)、帶有His-標簽目的蛋白的破碎菌液和B1-抗目的蛋白Ab (生物素標記的抗目的蛋白的多克隆抗體)混合孵育，如果目的蛋白成功表達，則會形成受體球-His-tag Ab-目的蛋白-B1-抗目的蛋白Ab復合物，再加入親和素標記的供體球，則親和素與生物素結合，利用活性氧激發能量轉移，產生發光現象，通過儀器讀取信號值。
[0015]優選的，步驟I)中，帶有His標簽目的蛋白的破碎菌液的0D_nni為0.1?0.5。
[0016]優選的，所述步驟2)中，偶聯抗His-標簽抗體的受體球溶液、帶有His標簽目的蛋白的破碎菌液、生物素標記的抗目的蛋白的多克隆抗體溶液的體積比為1:1:1。
[0017]優選的，所述偶聯抗His-標簽抗體的受體球溶液是偶聯抗His-標簽抗體的受體球與受體稀釋液按體積比1:50進行調配的，優選的，受體稀釋液為Tris-HCl緩沖液，其pH為 8.0，濃度為 0.lmol/Lo
[0018]優選的，所述生物素標記的抗目的蛋白的多克隆抗體溶液是生物素標記的抗目的蛋白的多克隆抗體與生物素抗體稀釋液按體積比1:2000進行調配的；優選的，所述生物素抗體稀釋液為PBS緩沖液，其pH為7.4，濃度為0.lmol/Lo
[0019]優選的，步驟3)中，向每個孔加入的親和素標記的供體球溶液與帶有His標簽目的蛋白的破碎菌液的體積比為1: 7，優選的，親和素標記的供體球溶液的濃度為20微克/毫升。
[0020]本發明同時提供了如上所述的試劑盒在檢測重組蛋白表達中的應用。
[0021]相對于現有技術，本發明所述的試劑盒，具有以下優勢:
[0022](I)操作簡單兩次溫浴累計75min，整個檢測過程不超過90min，而常用的免疫印跡試驗至少需要2個工作日(48h)。特別是本方法屬于均相發光免疫分析系統，整個檢測過程無“洗滌”環節，檢測效率更高，精密度更強。
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