檢測五氯酚鈉的酶聯免疫試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及酶聯免疫檢測技術，具體涉及一種用于檢測五氯酚鈉的酶聯免疫試劑 盒，可定性、定量檢測蝦肉、魚肉、豬肉及水樣本中五氯酚鈉藥物的殘留量。
【背景技術】
[0002] 五氯酸鈉（Pentachlorophenol-Na，簡寫PCP-Na)是五氯酸的鈉鹽，屬有機氯農 藥，通常為白色針狀或鱗片狀結晶，易揮發，有明顯的刺鼻氣味。易溶于水，4°C時溶解度為 20. 8%，其水溶液有強烈的酚臭味，性質穩定，在陽光的直接照射下不易分解。五氯酚鈉作 為一種高效、廉價的殺蟲劑、抗菌劑、防腐劑和除草劑，在世界范圍內被廣泛使用。20世紀 50-60年代，我國曾經大量使用五氯酚鈉鹽殺滅血吸蟲的寄主釘螺，效果明顯，但五氯酚鈉 性質比較穩定，對水體造成污染。同時，五氯酚鈉在動植物體內的富集率高，可通過食物鏈 進入人體，嚴重危害人體健康。因此，美國環境保護署（EPA)將五氯酚鈉列為可疑致癌物 質，并限制其使用。我國農業部于2002年也將五氯酚鈉列入《食品動物禁用的獸藥及其化 合物清單》，禁止在水生動物養殖中使用。
[0003] GB29708-2013《食品安全國家標準動物性食品中五氯酚鈉殘留量的測定》使用氣 相色譜-質譜法測定動物性食品中的五氯酚鈉殘留量，儀器方法具有靈敏度高、結果準確 等優點，但是資金和人員等投入成本較高。本發明應用酶聯免疫法，測定蝦肉、魚肉、豬肉及 水樣本中五氯酚鈉藥物的殘留量，具有檢測限低、特異性強、操作簡便、檢測速度快、檢測成 本低，非常容易推廣等優點。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種能夠檢測蝦肉、魚肉、豬肉及水樣本中五氯酚鈉藥物 殘留量的酶聯免疫試劑盒，并提供一種高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量 檢測方法。
[0005] 本發明試劑盒，它包括：包被有包被原的酶標板、五氯酚鈉標準品溶液、酶標二抗、 五氯酚鈉特異性抗體、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液，所述包被原為五氯酚鈉偶聯抗 原，所述酶標二抗為酶標記的羊抗鼠抗抗體。
[0006] 所述五氯酚鈉偶聯抗原是由五氯酚鈉半抗原與載體蛋白偶聯得到，所述五氯酚鈉 半抗原是由五氯酚鈉和4-溴丁酸乙酯反應得到，所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋 白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原。
[0007] 所述五氯酚鈉特異性抗體是以五氯酚鈉偶聯抗原作為免疫原制備獲得，所述五氯 酚鈉特異性抗體可為五氯酚鈉單克隆抗體或五氯酚鈉多克隆抗體，其中優選五氯酚鈉單克 隆抗體。
[0008] 所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶，其中優選辣 根過氧化物酶；酶標二抗是采用改良后的過碘酸鈉法進行偶聯得到的。
[0009] 為了更方便現場監控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括五氯酚鈉標準品溶液、 底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液。
[0010] 所述五氯酚鈉標準品溶液6瓶，濃度分別為0i!g/L、0. 05i!g/L、0. 15i!g/L、 0.45ug/L>1. 35ug/L>4. 05ug/L〇
[0011] 當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成， A液為過氧化氫或過氧化脲，B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺，所述終止液為1~2mol/L的 硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，所述底物顯色液為對硝基磷酸 鹽緩沖液，所述終止液為1~2mol/L氫氧化鈉溶液。
[0012] 所述洗滌液優選為口11值為7.4，含有0.5%~1.0%吐溫-20、0.01%。~0.03% 〇疊 氮化鈉防腐劑、〇. 1~〇. 3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。
[0013] 所述復溶液優選為pH值為7. 0、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體 積百分比。
[0014] 其中在酶標板制備過程中所用到的包被緩沖液為pH值為9. 6,0. 05mol/L的碳酸 鹽緩沖液，封閉液為pH值為7. 1~7. 5,含有1 %~3%酪蛋白、0. 1~0. 3mol/L的磷酸鹽 緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。
[0015] 本發明中酶標板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成20iig/ml，每孔加 入100iil，25°C避光孵育2h或4°C過夜，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干， 然后在每孔中加入150~200yl封閉液，25°C避光孵育1~2h，傾去孔內液體拍干，干燥后 用鋁膜真空密封保存。
[0016] 本發明的檢測原理為：
[0017] 本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中 殘留的五氯酚鈉與微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗五氯酚鈉的抗體，加入酶標二抗后， 用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含五氯酚鈉的含量成負相關，與標準曲線比較再乘以 其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中五氯酚鈉的殘留量。
[0018] 本發明還提供了一種應用上述酶聯免疫試劑盒檢測五氯酚鈉的方法，它包括步 驟：
[0019] ⑴樣品前處理；
[0020] (2)用試劑盒進行檢測；
[0021] (3)分析檢測結果。
[0022] 本發明檢測五氯酚鈉的酶聯免疫試劑盒主要采用ELISA方法定性或定量檢測樣 品中五氯酚鈉的含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批 量樣品；主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確 度高、準確度高等特點。本發明的酶聯免疫試劑盒，結構簡單、使用方便、價格便宜、攜帶便 利、檢測方法高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量。
【附圖說明】
[0023] 圖1 :五氯酚鈉半抗原合成路線圖
[0024] 圖2 :五氯酚鈉半抗原核磁共振氫譜圖
[0025] 圖3:試劑盒標準曲線圖
【具體實施方式】
[0026] 下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發明，而不用來限制本發明的范圍。
[0027] 實施例1試劑盒組分的制備
[0028] 1、五氯酚鈉半抗原的制備
[0029] 1. 0g五氯酚鈉與4溴丁酸乙酯在DMF中，在無水碳酸鉀與碘化鈉的催化下，反應生 成五氯酚-4溴-丁酸乙酯產物，經乙酸乙酯萃取，水洗，柱層析純化分離，得到中間產物，中 間產物在氫氧化鉀的水溶液中加熱反應，水解生成半抗原，經乙酸乙酯提取，二氯甲烷重結 晶，得到半抗原產物。
[0030] 取上述產物經核磁共振氫譜測定，如圖2所示，化學位移在4.Oppm處的為鄰近酚 氧的亞甲基信號峰，2.Oppm處兩組為亞甲基信號峰，llppm處為羧基氫信號峰，說明半抗原 合成成功。
[0031] 2、抗原的制備
[0032] 免疫原制備--五氯酚鈉半抗原與牛血清白蛋白（BSA)偶聯得到免疫原。
[0033]取18mg半抗原，溶解于lmLDMF中，得到溶液（1)，取氯甲酸異丁酯50ul加入（1) 中，4°C下攪拌30min，得到反應液A。稱取BSA50mg，使之充分溶解在4.OmLPBS(PH7. 2) 中，將反應液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，用0.Olmol/LPBS4°C透 析3d每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質。分裝，于-20°C保存備用。
[0034] 包被原制備--五氯酚鈉半抗原與卵清蛋白（0VA)偶聯得到免疫原。
[0035] 取18mg半抗原，溶解于lmLDMF中，得到溶液（1)，取氯甲酸異丁酯50ul加入（1) 中，4°C下攪拌30min，得到反應液A。稱取OVA50mg，使之充分溶解在4.OmLPBS(PH7. 2) 中，將反應液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，用0. 01mol/LPBS4°C透 析3d每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質。分裝，于-20°C保存備用。
[0036] 3、五氯酚鈉單克隆抗體的制備
[0037] 動物免疫：將上述步驟得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內，免疫劑量為 150iig/只，使其產生抗血清。
[0038] 細胞融合和克隆化：小鼠血清測定結果較高后，取其脾細胞，按8:1(數量配比）比 例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限 稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到分泌五氯酚鈉單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0039] 細胞凍存和復蘇：將單克隆雜交瘤細胞株用凍存液制成IX106個/ml的細胞懸 液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37 °C水浴中速融，離心去除凍存液后， 移入培養瓶內培養。
[0040] 單克隆抗體的生產與純化：將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 5ml/只，7天后 腹腔注射穩定的單克隆雜交瘤細胞株5X105個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸 銨法進行腹水純化，-20°C保存。
[0041] 4、酶標二體的制備
[0042] 將羊抗鼠抗抗體與辣根