白刺種子或其提取物中ss或/和rsMTCA的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及從白刺種子或其提取物中同時檢測兩種手性生物堿的方法。
【背景技術】
[0002] 白刺種子中含有多種活性成分，目前從白刺種子中分離得到了很多活性物質，主 要有以下幾類物質，黃酮類：槲皮素、異鼠李素-7-0-a-L-鼠李糖甙、山奈素-7-0-a-L-鼠 李糖甙、異鼠李素-7-0-0-D-葡萄糖甙、槲皮素-7-0-a-L-鼠李糖甙、異鼠李糖、尿囊 素、胡蘿卜苷、異鼠李糖；生物堿類：L-色氨酸、尿囊素和1-甲基_1，2,3,4_四氫-0-咔 啉-3-駿基酸（1-Methyl-l，2, 3,4_tetrahydr〇- 0 -carboline-3-carboxylicacid，簡稱 MTCA)〇
[0003] MTCA屬于吲哚類生物堿，目前吲哚類生物堿的研究已成為抗腫瘤藥物活性的熱 點。特別是在新藥及其新藥先導化合物發現中起著不可替代的作用。吲哚類生物堿抗腫瘤 成分主要對卵巢癌、淋巴癌和消化道系統癌如肝癌、結腸癌等有較顯著的療效。此外，吲哚 類生物堿抗腫瘤成分在誘導腫瘤細胞分化、促進腫瘤細胞凋亡以及提高機體免疫方面亦表 現出一定的作用。MTCA活性實驗表明MTCA具有較強的清除羥基自由基的能力，在細胞濃度 低于30yg/mL時對人表皮細胞Hucat時有一定的促進作用，同時對人肝癌細胞7221細胞 有促進凋亡的作用。
[0004] 研究表明MTCA廣泛的存在于食品中如小麥、黑麥面粉、大豆蛋白、牛乳以及酒精 飲料如啤酒和紅酒中。從食品、酒精飲料以及生物樣品分離出來的MTCA通常會包括兩種類 型（1S，3S)-1-甲基-1，2,3,4-四氫-0-咔啉-3-羧基酸（簡稱ssMTCA)和（1R，3S)-1-甲 基-1，2,3,4-四氫-0-咔啉-3-羧基酸（簡稱rsMTCA)。在兩個MTCA的非對映體中，ssMTCA 的含量是rsMTCA含量的四倍之多。對兩種異構體的提取分離研究，可以為更好地認識各異 構體生理活性打下基礎。
[0005]
[0006] 目前，還未見對白刺種子或其提取物中的ss、rsMTCA進行HPLC檢測報道。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的就在于提供一種對白刺種子或其提取物中ssMTCA或/和rsMTCA進 行檢測的方法。
[0008] 具體地，本發明提供了白刺種子中（1S，3S)或/和（1R，3S)構型的1-甲基_1，2， 3,4_四氫-咔啉-3-羧基酸的檢測方法，它是采用HPLC技術進行測定的，具體操作如 下：
[0009] (1)供試品溶液的制備：
[0010] 取白刺種子，以乙醇水溶液為溶劑進行提取，提取液回收乙醇至無醇味，加入石油 醚進行萃取，取水層，上大孔吸附樹脂柱，依次用水、10%V/V乙醇溶洗脫，收集10%V/V乙 醇洗脫液，濃縮、干燥即得粗提物，取粗提取物制備供試品溶液即可；
[0011] (2)將供試品溶液注入高效液相色譜儀中，對（1S，3S)或/和（1R，3S)構型的1-甲 基-1，2, 3,4-四氫-0 -咔啉-3-羧基酸進行測定即可，其中，色譜條件如下：
[0012] 色譜柱：十八烷基鍵合硅膠柱；
[0013] 流動相A:甲醇；流動相B:水；梯度洗脫條件：0-16min，10 % -27 %V/VA; 16-21min，27% -29%V/VA;21-35min，29% -45%V/VA;檢測波長：254 ~280nm，優選為 254nm〇
[0014] 本發明一個【具體實施方式】中，使用的色譜柱型號為AgilentEclipse)(DB-C18。
[0015] 其中，步驟⑴中，提取所用乙醇的濃度為65%~95%，進一步為70%~80%，優 選為 75%V/V。
[0016] 進一步地，所述大孔吸附樹脂為非極性大孔吸附樹脂。
[0017] 更進一步地，所述大孔吸附樹脂為D101樹脂。
[0018] 其中，供試品溶液的溶劑為水。
[0019] 其中，步驟（2)中，流動相流速為0? 5~lmL/min，優選為lmL/min;柱溫為25~ 30°C，優選為 30°C。
[0020] 其中，步驟（2)中，采用面積歸一法或者外標法對（1S，3S)或/和（1R，3S)構型的 1-甲基-1，2, 3,4-四氫-0 -咔啉-3-羧基酸進行測定。
[0021] 本發明還提供了白刺種子提取物中（1S，3S)或/和（1R，3S)構型的1-甲基_1，2， 3,4_四氫-咔啉-3-羧基酸的檢測方法，它是采用HPLC技術進行測定的，具體操作如 下：
[0022] (1)供試品溶液的制備：
[0023] 取白刺種子提取物，溶解后制備成供試品溶液；其中，白刺種子提取物由如下方法 制備得到：
[0024] 取白刺種子，以乙醇水溶液為溶劑進行提取，提取液回收乙醇至無醇味，加入石油 醚進行萃取，取水層，上大孔吸附樹脂柱，依次用水、10%V/V乙醇溶洗脫，收集10%V/V乙 醇洗脫液，濃縮、干燥即得粗提物；取正丁醇：0.5%甲酸=5 : 6V/V，置于分液漏斗中配制 兩相溶劑系統，取上相為固定相，下相為流動相；取粗提物，溶解于適量固定相和流動相的 混合液中，得到樣品溶液；以20~40mL/min的流速將固定相栗入主機并充滿分離螺線管， 保持溫度25~30°C，主機正向旋轉，轉速為800~1000r/min，以1. 5~3.OmL/min的速度 栗入流動相，待流動相從管柱口流出且基線穩定后，注入樣品溶液，在254~280nm波長下 進行檢測，收集出峰時間300~350min的成分，即得白刺種子提取物；
[0025] (2)將供試品溶液注入高效液相色譜儀中，對（1S，3S)或/和（1R，3S)構型的1-甲 基-1，2, 3,4-四氫-0 -咔啉-3-羧基酸進行測定即可，其中，色譜條件如下：
[0026] 流動相A:甲醇；流動相B:水；梯度洗脫條件：0-16min，10 % -27 %V/VA; 16-21min，27% -29%V/VA;21-35min，29% -45%V/VA;檢測波長：254nm。
[0027] 進一步地，步驟（1)中，固定相的流速為30mL/min，溫度為30°C，主機轉速為900r/ min，流動相的流速為1. 7mL/min。
[0028] 進一步地，步驟（2)、（3)中，檢測波長為254nm。
[0029] 本發明的有益效果：
[0030] (1)本發明首次在唐古特白刺種子中發現了rsMTCA，基于MTCA在食物、醫藥領域 的實用性，對白刺種子或其提取物中的ssMTCA和rsMTCA的檢測也顯得十分必要。本發明 利用特定的流動相洗脫條件，首次實現了分別或同時對白刺種子或其提取物中的ssMTCA、 rsMTCA的檢測，為白刺種子或其提取物的開發利用提供了保障。
[0031] (2)ssMTCA和rsMTCA互為光學異構體，兩者僅只有在1位的甲基取代構象不同，兩 者的化學性質極為相近。毋庸置疑，兩者的極性也十分接近，高效液相色譜是利用不同化合 物在流動相和固定相之間的極性選擇差異來對不同化合物進行分離從而實現檢測的，若是 希望使用液相色譜技術將兩個極性極為相似的化合物進行分離，是極其困難的。梯度洗脫 是面對復雜分離過程的首選洗脫方式，然而，梯度洗脫過程中，流動相種類、梯度程序（即 時間和相對應的流動相配比）的選擇是無限的，如何選擇一種適合于ssMTCA和rsMTCA的 梯度洗脫條件，是需要發明人付出大量的實踐和總結、分析才能得到的。本發明最終發現 的流動相梯度洗脫條件，能夠有效將白刺種子中的多種化學成分分離，更重要的是，能夠將 ssMTCA和rsMTCA分開，為兩者化合物的分別測定提供了基礎。
【附圖說明】
[0032] 圖1白刺種子中ssMTCA和rsMTCA的HPLC檢測圖譜
[0033] 圖2白刺種子提取物制備過程中的逆流色譜圖
[0034] 圖3白刺種子提取物中ssMTCA和rsMTCA的HPLC檢測圖譜
[0035] 圖4ssMTCA對照品的HPLC圖譜
[0036] 圖5rsMTCA對照品的HPLC圖譜
[0037] 圖6半制備色譜圖
[0038] 圖7流動相梯度為0-16-21-35min(10%-29%-29%-45%甲醇）時的色譜圖，其 檢測的供試品溶液同實施例1