一種同時檢測高分子量和低分子量谷蛋白亞基的電泳方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種同時檢測高分子量和低分子量谷蛋白亞 基的電泳方法。
【背景技術】
[0002] 高分子量（HMW)麥谷蛋白亞基組成是預測小麥品質的一項重要指標，自應用 SDS-PAGE分離蛋白質多肽混合物以來，各國的科學家根據已有實驗條件，逐步摸索，提出 了許多用來分析高分子量（HMW)麥谷蛋白亞基的SDS-PAG方法，在SDS-PAGE實驗中，獲得 準確可靠、分辨率高的高分子量（HMW)麥谷蛋白亞基圖譜是品質鑒定、篩選優良品種的重 要保證。此實驗要求條件比較嚴格，需要在冷卻循環的環境下進行，對上樣蛋白的質量要求 較高，且電泳時間較長，迀移率相近的亞基很難區分、工作量較大、耗費的時間較長。同時低 分子量（LMW)蛋白檢測也存在工作量大、耗費時間長的問題。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的之一是為解決尚分子量和低分子量谷蛋白檢測工作量大，耗時長， 效率低的問題，提供一種相對簡單、高效的，能夠同時檢測高分子量和低分子量谷蛋白亞基 的電泳方法。
[0004] 本發明提供一種同時檢測高分子量和低分子量谷蛋白亞基的電泳方法，包括提取 谷蛋白亞基和制膠電泳，所述制膠電泳包括以下步驟：
[0005] 將玻璃板清理干凈，再用蒸餾水沖洗晾干；
[0006] 將制膠器放平，用1mm膠條放在玻璃板兩側，將兩塊玻璃板蓋上，用兩邊旋鈕上 緊；
[0007] 配制分離膠，吸取所述分離膠，向所述玻璃板直接灌膠，控制灌膠速度，至離上玻 璃板面3cm處停止灌膠，加超純水至膠面形成兩相界面，將膠面壓平且防止膠面干燥，在室 溫下凝膠45min;
[0008] 分離膠聚合以后，將水倒出，用濾紙把剩余的水吸干；
[0009] 配制濃縮膠，搖勻灌膠，插入梳子，室溫下凝聚30min;
[0010] 拔出梳子，用lx電極緩沖液沖洗樣槽，將凝膠轉移到電泳槽上，調整點樣孔；
[0011] 電泳槽中加入電極緩沖液，每個點樣孔上樣10y1，穩流30mA/板，電泳3. 5h后停 止；
[0012] 取下膠后，先用超純水洗膠一次，去掉點樣時的梳孔膠，在膠的一邊切去一角，做 好標記，再加染色液，置搖床上染色過夜；
[0013] 過夜后，用脫色液脫色至背景清晰，然后用蒸餾水沖洗2遍，拍照分析，晾干保存。
[0014] 進一步的，所述配制分離膠為取30%丙烯酰胺溶液10. 72ml、pH8. 8的1. 5mol/L Tris-HC13. 75ml和10 %SDS(十二烷基硫酸鈉）溶液200y1混合，最后加入APS(過硫酸 銨）200y1和TEMED(N，N，N'，N' -四甲基乙二胺）20y1，用超純水定容至200ml，立刻搖勻 即得。
[0015] 進一步的，所述配制濃縮膠為取30 %丙烯酰胺溶液2. 50ml、pH8. 8的1. 5mol/L Tris-HC13. 75ml和10 %SDS(十二烷基硫酸鈉）溶液150y1混合，最后加入APS(過硫酸 銨）56y1和TEMED(N，N，N'，N' -四甲基乙二胺）18. 2y1，用超純水定容至200ml，搖勻即 得。
[0016] 進一步的，所述電極緩沖液為取甘氨酸72g、Trisl4. 4g和10%SDS(十二烷基硫 酸鈉）溶液l〇ml混合，用超純水定容至1L，搖勻即得。
[0017] 進一步的，所述染色液為取考馬斯亮藍R-250 1. 0g、甲醇500ml、乙酸100ml和蒸 餾水400ml混合，搖勻即得。
[0018] 進一步的，所述脫色液脫色時間3h;所述蒸餾水脫色時間Id;所述脫色液為取甲 醇200ml、乙醇70ml和蒸餾水730ml混合，搖勻即得。
[0019] 進一步的，所述提取谷蛋白亞基步驟包括：
[0020] 將種子制成粉末；
[0021] 將所述粉末倒入離心管，加入提取液A，充分混合均勻后放置搖床上；
[0022] 搖好的離心管離心后棄上清液，將離心管倒扣在吸水紙上吸水，再加入提取液 充分震蕩，水浴加熱后離心；
[0023] 取離心后的上清液，置于另一離心管中然后加入提取液B2，充分混勻，水浴加熱；
[0024] 然后加入提取液C，充分混勻，水浴加熱后，放置冰箱備用。
[0025] 進一步的，所述提取液A為取7. 5ml正丙醇、0. 3MNal，加雙蒸水定容至100ml;提 取液A加入量為lml，搖床溫度為60°C或常溫，時間大于lh。
[0026] 進一步的，所述提取液隊為取體積分數50%的正丙醇和0? 08M，PH8. 0的Tris-Hcl 按1:1混合，再加入相當于混合溶液體積1. 0%的DTT(二硫蘇糖醇），搖勻即得；所述提取 液隊加入量為100y1，水浴條件為60°C，大于30min，離心條件為10000r/min離心5min。
[0027] 進一步的，所述提取液B2為取體積分數50%的正丙醇和0? 08M，PH8. 0的Tris-Hcl 按1:1混合，再加入相當于混合溶液體積1. 4%的4-VP(4-乙烯基吡啶），搖勻即得；所述上 清液與提取液B2均為50y1，水浴條件為65°C，15min。
[0028] 進一步的，提取液C為質量分數2 %的SDS(十二烷基硫酸鈉），質量分數40 %的甘 油40ml，質量分數0. 02%的溴酚藍和0. 08M，PH8. 0的Tris-HclO. 02g混合溶液；提取液C 加入量為〇.lml，水浴條件為65°C，15min。
[0029] 本發明的有益效果在于：本發明的同時檢測高分子量和低分子量谷蛋白亞基的電 泳方法，能夠同時檢測高分子量和低分子量谷蛋白亞基，方法操作簡單，工作量小，檢測快 捷。
【附圖說明】
[0030] 圖1所示為本發明同時檢測高分子量和低分子量谷蛋白亞基的電泳方法的電泳 圖。
【具體實施方式】
[0031] 下文將結合具體實施例詳細描述本發明。應當注意的是，下述實施例中描述的技 術特征或者技術特征的組合不應當被認為是孤立的，它們可以被相互組合從而達到更好的 技術效果。
[0032] 本發明的同時檢測高分子量和低分子量谷蛋白亞基的電泳方法，包括提取谷蛋白 亞基和制膠電泳。
[0033] 提取谷蛋白亞基步驟包括：
[0034] 將種子放在稱量紙片上，然后用錘子將種子砸細成粉末。
[0035] 將砸碎的粉末倒入1. 5ml離心管，然后加入lml提取液A(每100ml提取液含7. 5% 正丙醇+0. 3MNal，加dd水定容至100ml)，充分混合均勻后放置60°C搖床上搖lh以上（亦 可在常溫）。
[0036] 然后在10000r/min離心5min后棄上清，將離心管倒扣在吸水紙上幾分鐘，保證 去除干凈，加入100y1提取液隊（體積分數50%的正丙醇和0. 08M，PH8. 0的Tris-Hcl按 1:1混合，再加入相當于混合溶液體積1. 0%的dtt，搖勻即得。）充分震蕩，60°C水浴至少 30min后 10000r/min離心 5min。
[0037] 取上清50y1于另一離心管中然后加入等體積的提取液B2 (體積分數50%的正丙 醇和0. 08M，PH8. 0的Tris-Hcl按1:1混合，再加入相當于混合溶液體積1. 4%的4-VP，搖 勻即得。）充分混勻，65°C水浴15min。
[0038] 然后加入0. 1ml提取液C(質量分數2%的SDS，質量分數40%的甘油40ml，質量 分