流體熒光定量檢測裝置及方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及流體標記物檢測技術領域，特別是涉及流體熒光定量檢測裝置，及應 用該裝置定量測定流體中目標檢測物含量的方法。
【背景技術】
[0002] 標記物檢測技術的原理是：標記物通過免疫反應法、化學反應法、生化反應法、 鏈霉親和素和生物素等包被技術，制作成探針；探針通過相應的反應與目標物質結合；檢 測儀器通過對標記物的檢測，測定出目標物質的濃度。目前，標記物檢測技術已經廣泛用 于醫療檢測、微生物檢測、微量元素測定等領域，例如電化學熒光標記分析（ECLI)、酶聯免 疫吸附試驗（ELISA)、放射免疫分析（RIA)、熒光免疫分析（FIA)、時間分辨熒光免疫分析 (TRFIA)等熒光免疫分析技術。
[0003] 標記突光的免疫分析方法，近年發展迅速，比較具有代表性的是羅氏Elecsys2010 電化學熒光標記分析方法（ECLI)。該方法采用鏈霉親和素（streptoavidin，SA)和生物素 (biotin，B)包被技術，將抗原(或抗體）包被在直徑2. 8 ii m的聚苯乙烯磁性微球上，熒光標 記物采用具有電激發化學光特性的三聯吡啶釕。當磁性微球、熒光標記物與樣品中的檢測 目標物質反應后，目標物質會攜帶熒光標記物聚集在磁性微球表面。Elecsys利用磁性微 球的磁性特征，將磁性微球固定在電磁鐵周圍，然后進行沖洗，清除游離的熒光標記物。清 洗后的微球放置在檢測區域，施加電場，使電化學發光的突光標記物質被激發出波長620nm 的熒光，通過檢測高特異性的熒光強度，參考標準曲線，實現目標物質的定量測定。
[0004] 酶標法（ELISA)，將抗原或抗體與酶用膠聯劑結合成為酶標抗原或抗體，將樣品池 內壁包被同樣的抗原或抗體。加入樣品和酶標抗原或抗體，樣品中的目標檢測物抗體或抗 原使酶標抗原或抗體可與內壁上的抗原或抗體發生特異反應，并牢固地結合，形成仍保持 活性的免疫復合物。然后，加入相應底物將免疫復合物顯色，通過參考標準曲線或對比顏色 標準板，根據顏色深淺，定量檢測目標檢測物含量。為檢測顏色深淺，需對樣品池中游離在 溶液中的酶標、雜質和底物進行清洗和參考標準樣品。
[0005] 時間分辨熒光免疫法（TRFIA)，在樣品反應、清洗等與熒光免疫法（FIA)基本類 似，只是檢測的是更高特性的時間分辨熒光，而非普通FIA檢測光激發的瞬時熒光。TRFIA 要求在關掉激發光源后100Ps-lms的時間段內檢測熒光，雖然熒光具有高特異性，但由于 熒光本身具有衰減周期，導致激發光源強度、以及檢測計時誤差會引起檢測誤差，因此對檢 測儀器的一致性要求更高，一般需要儀器在檢測樣品同時，檢測標準樣品池，以保證標準曲 線的有效性。
[0006] LumineX200流式熒光檢測儀是液相熒光檢測儀的代表產品，其檢測方法是采用 直徑5. 6 y m的聚乙烯微球作為標識微球，標識微球能在635nm光照射時激發兩個波長突 光并且強度對比值不同，根據強度比值進行100種編碼，分別代表100種標識微球。熒光 標記物是在532nm光照射時能激發575nm波長熒光的物質。當溶液中存在目標檢測物時， 突光標記物將附著在相應的標識微球周圍。檢測時，儀器通過檢測635nm識別標識微球編 碼，然后根據575nm不同編碼微球上的標記熒光強度，參考標準曲線，得到標識微球所結 合的目標檢測物含量。LumineX200通過流式檢測溶液在細小石英管內對依次通過的微球 進行逐粒檢測，因此它是一種液相熒光標記逐粒檢測方法。逐粒檢測技術的關鍵是要求每 個微球保持距離，不能相互干擾，否則會造成檢測結果假陽性。為了讓5. 6ym的微球在 500iimX500iim內徑的石英管內依次通過，LumineX200流式熒光檢測儀采用了兩個關鍵 技術避免微球層疊：一個是通過使用流式技術將標識微球在石英管內依次排列；另一個是 通過檢測微球散射光，識別確認微球是否層疊。流式技術就是利用流動的鞘液的流體力學 原理，使微球在液柱中心排列通過。但流式技術不能保證微球一定會依次排列通過檢測窗 口，因此，作為辨別，LumineX200引入了微球散射光檢測，當發現散射光異常變化時，系統自 動舍棄該微球的標記熒光檢測結果，不納入檢測統計結果。由于lumineX200使用鞘液，導 致了溶液成分改變，因此必須將得到的標記熒光強度，比對參考標準曲線，才能得到檢測結 果。
[0007] 綜上，目前常規的熒光標記檢測技術，都存在以下無法克服的問題：
[0008] 1.為準確獲得結合了目標檢測物的標記熒光強度，需要清洗和分離，避免樣品溶 液中的雜質和溶液中游離的標記物所產生的特異性熒光疊加在熒光背景上，影響檢測結 果。
[0009] 2.檢測的目標物熒光強度，與目標物含量，需要參考標準曲線才能關聯。
[0010] 3.由于檢測結果要依賴于參考標準曲線，因此檢測實驗需要完全模擬標準品的參 考曲線測定場景，如：樣品及試劑投放量，清洗、分離步驟，檢測儀器量程定標，熒光物質發 光能力定標，環境溫度等等，都需要與標準品的測定場景一致。苛刻的試驗條件要求，反而 可能導致極低的可重復性。
【發明內容】
[0011] 本發明要解決的技術問題之一是提供一種流體熒光定量檢測裝置，它能準確檢測 流動液體中的熒光標記物的熒光強度，且具有使用方便、抗干擾能力強、檢測效率和靈敏度 _的優點。
[0012] 為解決上述技術問題，本發明的流體熒光定量檢測裝置，包括液體流動系統、光路 系統和數據處理系統，其中：
[0013] 液體流動系統包括吸液裝置、石英管、微球約束腔和連接管；所述吸液裝置用于抽 吸溶液；所述石英管上端連接吸液裝置，下端連接微球約束腔，中部開有檢測窗口；所述微 球約束腔用于使微球并列進入石英管，該微球約束腔包括有入口腔、限流口和出口腔，入口 腔與連接管上端連接，出口腔與石英管下端連接，限流口為狹縫通孔，狹縫寬度小于微球在 溶液中的最小自由距離；所述連接管下端浸入溶液中，用于作為液體流通的管路；
[0014] 光路系統包括激發光產生裝置、檢測窗口、帶通濾光片及光電轉換器；所述激發光 產生裝置用于激發熒光標記物產生熒光；所述檢測窗口為透光狹縫，狹縫開口與石英管垂 直，并與約束腔限流口開口方向平行；所述帶通濾光片用于選擇性透過所需波段的光；所 述光電轉換器用于將透過帶通濾光片的光轉換成電信號；
[0015] 數據處理系統包括數據處理器和用戶操作界面；所述數據處理器用于控制吸液裝 置和激發光產生裝置，采集并處理光電轉換器的光電數據；所述用戶操作界面用于用戶操 作信息交互及輸出檢測結果。
[0016] 本發明要解決的技術問題之二是提供應用上述流體熒光定量檢測裝置定量檢測 流體中目標物濃度的方法，該方法包括以下步驟：
[0017] 1)將標定了可結合目標檢測物總量和結合系數的熒光標記物與聚集在標識微球 表面的目標檢測物進行結合反應；
[0018] 2)抽取步驟1)得到的混合溶液，流經微球約束腔，使標識微球在石英管內并列且 勻速地通過石英管；
[0019] 3 )連續采集流動溶液的標記熒光信號；
[0020] 4)分辨標識微球表面所聚集的標記物熒光信號；
[0021] 5)在連續的檢測時間段內，計算標識微球的標記熒光強度和，以及溶液的全部標 記熒光強度和，根據熒光標記物所標定的可結合目標檢測物總量和結合系數，利用多元線 性回歸公式計算出目標檢測物的含量。
[0022] 所述目標檢測物包括甲狀腺、性激素、骨代謝、心肌梗塞、腫瘤標志物、傳染病抗原 抗體和核酸分子等。
[0023] 所述標識微球為單分散微球，可以使用聚苯乙烯微球、硅膠微球以及聚吲哚類雜 環化合物、聚苯胺等導電高分子微球。標識微球的體積越大，聚集目標檢測物的能力越強， 其激發出的標記熒光強度與游離溶液中的標記熒光強度的差異也會越大，因此，為了提高 檢測靈敏度，宜選用粒徑比較大的乳膠微粒(粒徑為5-500微米)。
[0024] 熒光標記物激發出熒光的能力與其包含的熒光物質的多少有關，因此，為了提高 檢測的靈敏度，宜選用粒徑在l〇nm到300nm之間的聚苯乙烯膠或硅烷等突光乳膠微粒。
[0025] 所述步驟4)，可以通過參考熒光信號的波峰和波谷，或參考微球的散射光信號，或 參考磁性微球的磁性特征，來分辨標識微球表面所聚集的標記物熒光信號。
[0026] 本發明通過使用獨創的微球約束腔，并采用單分散微球作為載體，避免了因微球 之間互相遮擋而影響熒