生物電鏡樣品碳化方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬生物樣品制備領域，具體涉及一種生物電鏡樣品碳化方法
【背景技術】
[0002] 電子顯微鏡誕生以來，研究人員對用于電子顯微鏡觀察的生物樣品的前期制備、 切片、染色的技術進行不斷的探索與改進，以求獲得更高品質的真實圖象和實驗結果。
[0003] 常規的透射生物電鏡樣品制備有包埋切片法，負染色法等。而常規的掃描電鏡樣 品制備常采用單一的臨界點干燥法（臨界點儀器冷凍干燥法，又稱冷凍干燥法），一般的 操作步驟為，取材大小在〇. 8_平方以內，用2. 5%戊二醛2ml，固定2小時或者更長時間， 〇. 1M磷酸緩沖液漂洗3次，每次15分鐘，然后用1 %四氧化鋨2ml固定2小時，0. 1M磷酸 緩沖液漂洗3次，每次15分鐘，50 %乙醇、70 %乙醇、90 %乙醇、各一次，每次15分鐘，100 % 乙醇三次、每次15分鐘，100%乙醇與醋酸已戊脂1:1混合，一次20分鐘，純醋酸已戊脂一 次20- 30分鐘，臨界點干燥。又萊卡現在有新的臨界點干燥無需醋酸已戊脂浸透過程，直 接從100%乙醇進入臨界點干燥。
[0004] 現有技術中生物樣品常規透射電子顯微鏡樣品制備如：心、肝、脾、肺、腎、皮膚、肌 肉、等以及各種類型的培養細胞的電鏡樣品都已經有一系列的完整的方法，其中不乏試劑 的選擇變化，如：不同環氧樹脂國產的618 (E51)、進口的Epon812與低粘度的Spurr的選擇 變換。透射電鏡樣品處理的一般方法：取材、前固定、漂洗、后固定、漂洗、乙醇梯度（50%、 70%、90%、）乙醇90%與丙酮90% 1:1混合液、100% *3次脫水。實踐顯示，在生物組織臨 界點干燥時，把控時間存在難度，在臨界點干燥儀器工作過程中，組織樣品體積內部的壓力 從開始的二氧化碳液體的50kg大氣壓上升達110大氣壓工作點，然后在進行排壓放氣，該 過程中由于組織內、外部壓力易形成一個倒壓差，易使組織發生爆裂，嚴重影響實驗效果。 以細菌為例，經過常規的掃描電鏡樣品制備、脫水與臨界點干燥后，少有細菌是飽滿的原來 的生態結構，細菌常出現大量凹凸的形態結構，不能達到基本完整的細菌原樣。
[0005] 現有技術中對于細菌、病毒、分子蛋白的透射電鏡的觀察可以用磷鎢酸負染色法 進行。但是，有些樣品受到臨界點條件制約，無法進行樣品的臨界點制備條件，不能進行掃 描電鏡觀察。如：氫化蓖麻油與脂肪醇聚氧乙烯醚（21)混合物、牛油樹脂與tween80混合 物，多聚賴氨酸等，目前尚無法對這些樣品進行臨界點干燥。一些有機高分子材料如多聚賴 氨酸等，在沒有進行樣品電子修復的情況下，觀察效果始終不能達到理想的結果或根本無 法觀察；另外，對于油脂類脂滴粒徑電鏡測定，尚無有令人滿意的樣品制備方法。
[0006] 本申請的發明人針對現有技術的現狀，擬提供一種生物電鏡樣品碳化方法，使一 些原來無法制備的透射電鏡樣品、掃描電鏡樣品能夠順利完成樣品制備達到電鏡觀察要 求。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是克服現有技術的缺陷和不足，提供一種用于電子顯微鏡的生物電 鏡樣品碳化方法
[0008] 本發明方法改變了一些常規的電鏡樣品制備方法，在整個實驗過程中對于實驗結 果有更好的表達結果，且環保低碳、操作簡便、整個樣品的化學物理收縮率小、形貌結構幾 乎無改變，細微結構清晰。
[0009] 本發明中：采用0. 1M四氧化鋨液體的揮發性氣體對生物有機樣品進行熏蒸、灼 燒，使生物有機樣品達到完全碳化以符合掃描電鏡觀察的要求，本發明突破了一些電鏡樣 品制備的瓶頸，使一些原來無法制備的透射電鏡樣品、掃描電鏡樣品能夠順利完成樣品制 備達到電鏡觀察要求。
[0010] 具體而言，本發明的生物電鏡樣品碳化方法，其特征在于，采用〇. 1M四氧化鋨液 體的揮發性氣體對生物有機樣品進行熏蒸、灼燒，使生物有機樣品完全碳化；其包括下述步 驟：
[0011] 1)生物類或有機高分子類掃描電鏡樣品處理：
[0012] 取離體動物或人體的器官組織塊，景常規處理快速用2. 5%戊二醛2ml固定2小時 或者更長時間，4〇C冷藏固定2小時以上，緩沖液漂洗2次，每次10分鐘；
[0013] 2)取電鏡鎳網做支架，將組織塊除去表面水漬，置于電鏡鎳網上面；或，將有機高 分子物質的懸浮液滴在含有碳膜的載網上面，經3-5分鐘的吸附，除去上清多余懸液，微干 備用；
[0014] 3)取底部加1 %濃度的四氧化鋨溶液的離心管，使其橫置、形成底部的液態漲力 留置；
[0015] 4)將置有組織的鎳網支架轉移至離心管的中部或者口端部，離心管封蓋以及加封 口膜封口、標注樣品性質、樣品標記號，集合多個離心管樣品放入統一的器皿，再封口，標注 碳化起始時間；
[0016] 5)轉移到冰箱4度冷藏空間開始碳化，不同的組織一般碳化時間在24-72小時 之間；
[0017] 6)取出已碳化的樣品，轉移樣品到新的離心管中、開蓋放置37〇C溫箱3-4小時，加 蓋封口保存；
[0018] 7)噴金、掃描電鏡觀察。
[0019] 本發明中，生物電鏡樣品包括生物樣品組織、細菌、有機高分子蛋白體等；
[0020] 本發明中，在EP離心管底部加100ul的1%濃度的四氧化鋨溶液，由于溶液的漲力 使溶液沉積于離心管底部，將離心管橫置、液體不會流失，形成底部的液態漲力留置；
[0021] 本發明中，所述的四氧化鋨具有如下所示的結構，通常由金屬鋨與氧氣在加熱的 條件下反應制得；
[0022]
[0023]外文名：osmiumtetroxide
[0024] 別名：鋨酸酐
[0025]化學式：0s04
[0026] 相對分子質量：254. 20
[0027] 化學品類別：無機物一金屬氧化物
[0028] 物理性質：
[0029]EINECS號：244-058_7
[0030]外觀與性狀：白色或淡黃色結晶，有類似氯的氣味。
[0031] 熔點（°C):41.0
[0032] 相對密度（水=1) :4. 91
[0033]沸點（°C):130
[0034]分子式：0s04
[0035]分子量：254. 20
[0036]飽和蒸氣壓（kPa) :0? 93/20°C
[0037] 溶解性：微溶于水，溶于乙醇、乙醚、四氯化碳、氨水。
[0038] 化學性質：
[0039] 在沸點以下，開始升華。微溶于水，水溶液呈中性，溶于濃堿呈黃色。是一種氧化 劑，可以氧化氫碘酸；
[0040] 所述的四氧化鋨通常用作微生物學試劑、照保材料、白熾燈罩、催化劑、氧化劑和 生物學中的氣體固定劑。
[0041] 本發明還提供了掃描電鏡樣品中類似油脂類的脂滴粒徑測定的制備方法，如：氫 化蓖麻油與脂肪醇聚氧乙烯醚（21)組成，牛油樹脂與tween80組成（失水山梨醇單油酸酯 聚氧乙烯醚（Tween80)簡稱乳化劑T-80)等。
[0042]本發明基于鋨酸的物理化學性質與鋨酸對于暴露在體表外面的粘膜有極強的燒 灼損傷作用，如：人體的鼻粘膜、口腔粘膜、眼睛角膜等，與鋨酸蒸汽接觸時間長了會受到燒 灼損傷等，利用鋨酸蒸汽對于生物組織、有機組織的燒灼損傷的原理，經試驗篩選確定了鋨 酸蒸汽對生物組織、有機組織熏蒸的時間，使生物組織、有機組織進入到碳化狀態，達到碳 化結構的抗力與漲力，最終完成掃描電鏡樣品與部分有機組織的透射電鏡觀察要求。
[0043] 本發明方法過程簡單易于操作，與常規生物有機樣品的電鏡樣品制備方法完全不 同，尤其是改變了常規方法的繁瑣的步驟，大量節約了試劑等使用，且環保低碳；其較現有 技術的明顯區別于，除需要二次固定的〇. 1M四氧化鋨液體的二十分之一液體量外，二次固 定以后所需要的PB漂洗、乙醇的梯度50%、70%、90%、100%、100 %、100%、醋酸已戊脂、 臨界點二氧化碳低溫干燥等可以全部省略，獲得的實驗結果明顯優于常規制備方法，該方 法中，還解決了一些常規樣品制備不能解決的問題，如：油脂類的脂滴粒、多聚賴氨酸樣品 制備等。本方法中就〇. 1M四氧化鋨液體使用值就可以達到百分之一,也就是常規樣品制備 一例需要的〇. 1M四氧化鋨液體量，按本方法可以制備一百例左右。
[0044] 表1是本方法與常規臨界點干燥方法制備掃描電鏡樣品的對比。
[0045]表1
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