綴合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫檢測領域，特別是涉及一種綴合物及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 梅毒（syphilis)又稱為"霉瘡"、"廣瘡"、"棉花瘡"或"楊梅瘡"，是一種慢性系統 性傳染病，被列為世界三大慢性傳染病之一。梅毒病原體是梅毒螺旋體，亦稱蒼白螺旋體 (Treponemapallidum,TP)，由德國的霍夫曼和謝文定在1905年首次發現。梅毒主要通過性 接觸和血液傳播，而婦女懷孕時如果感染梅毒，會經由胎盤傳染給胎兒，造成先天性梅毒。 梅毒可產生多種多樣的癥狀和體征，早期侵犯生殖器和皮膚，晚期侵犯全身各器官，尤其是 心血管和中樞神經系統，且時隱時顯，病程可持續很長，是僅次于艾滋病的嚴重危害我國人 民身體健康的性傳播疾病。據報道全世界每年約有一千二百萬例新感染病例，近年來梅毒 發病率在我國也有上升的趨勢，據2014年梅毒重點疫情報告，2009年以來梅毒位于乙類傳 染病報告發病數的第三，尤其是在產前門診篩查出的梅毒抗體陽性的孕婦顯著增加，給我 國的公共衛生帶來危害。但要確實證明感染梅毒并不容易，因為感染早期并無臨床癥狀，潛 伏期在10天至90天，只能靠檢測梅毒血清來幫助診斷，目前病人血清中的標志物主要是檢 測梅毒螺旋體（TP)抗體。
[0003] 目前，國內外對梅毒的發病機制和診斷方式進行了大量的研究，梅毒的實驗室診 斷主要包括：病原學診斷、組織病理學診斷、基因診斷、腦脊液檢查及血清學診斷，前四種診 斷方法易受條件制約、臨床較少開展。血清學診斷根據使用抗原不同分為兩類：非梅毒螺旋 體抗原血清學實驗（非特異性TP抗體）和梅毒螺旋體抗原血清學實驗（特異性梅毒抗體）， 非梅毒螺旋體抗原血清學試驗方法主要包括快速血漿反應素環狀卡片試驗（RPR)、不加熱 血清反應素試驗（USR)、研究實驗室試驗（VDRL)及甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST)，非梅 毒螺旋體抗原血清學實驗的主要缺點是敏感性和特異性不高，許多非梅毒性疾病，包括類 風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、慢性迀延性肝炎等均可呈陽性反應。梅毒螺旋體抗原血清 學試驗主要包括：梅毒螺旋體顆粒凝集實驗（TPPA)、梅毒螺旋體血球凝集實驗（TPHA)、熒 光螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS)、快速免疫層析試驗（RT)、免疫印跡試驗（WB)及酶聯免 疫吸附試驗（ELISA)，其中TPPA、TPHA、FTA-ABS、RT、WB試驗雖然可提高檢測的特異性，但有 的需制備大量病原體，有的檢測成本較高、操作繁瑣，且質量難以控制，不利于大規模的血 液篩查工作。因此，研制快速、簡便、靈敏且特異的TP體外診斷試劑是當前的主要任務。
[0004] 80年代初，隨著分子生物學技術的發展，特別是基因工程（DNA重組）技術的出現 使梅毒螺旋體的研究進入一個新的階段。酶聯免疫吸附試驗（ELISA)檢測方法應用免疫學 技術測定標本，通過抗原抗體反應檢測體液中的抗體或抗原性物質，是一種敏感的測定的 方法。酶聯免疫吸附試驗主要采用雙抗原夾心法檢測梅毒抗體，將檢測試劑中的抗原用可 微量測定的物質加以標記，通過標記物將信號放大，得出最終的判定結果。然而檢測試劑中 的抗原活性位點容易被標記物包裹，抗原活性位點被包埋將導致抗原活性降低。
【發明內容】
[0005] 基于此，有必要提供一種抗原活性位點不容易被標記物包裹的綴合物，以及其制 備方法和應用。
[0006] -種綴合物，包括突變型梅毒檢測抗原和標記物，所述突變型梅毒檢測抗原由梅 毒螺旋體抗原中間的1或2個賴氨酸突變后得到，所述標記物標記在所述突變型梅毒檢測 抗原的N端或C端的賴氨酸位點。
[0007] 在一個實施例中，所述突變型梅毒檢測抗原由梅毒螺旋體抗原中間的1或2個賴 氨酸突變為甘氨酸后得到。
[0008] 在一個實施例中，所述突變型梅毒檢測抗原包括：
[0009] (a)、由SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸編碼得到的多肽；
[0010] (b)、與SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸具有至少98%同源性的多 核苷酸編碼得到的多肽；或
[0011] (C)、由SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸，其中一個或多個堿基被 缺失、替代或增加得到的多核苷酸編碼得到的多肽。
[0012] 在一個實施例中，所述標記物為酶、化學發光物質、熒光物質、放射性物質和膠體 中的至少一種。
[0013] -種上述綴合物的制備方法，包括如下步驟：
[0014] 步驟一、提供用于表達突變型梅毒檢測抗原的基因表達序列，所述突變型梅毒檢 測抗原由梅毒螺旋體抗原中間的1或2個賴氨酸突變后得到；
[0015] 步驟二、將所述基因表達序列連接到基因表達載體中；
[0016] 步驟三、將所述基因表達載體轉化到宿主細胞中，所述宿主細胞為原核細胞；
[0017] 步驟四、對轉化了所述基因表達載體的所述宿主細胞進行誘導表達，分離得到表 達液；
[0018] 步驟五、在所述表達液中加入飽和硫酸銨至硫酸銨的終濃度為20%，充分靜止后 收集上清，接著在所述上清中加入飽和硫酸銨至硫酸銨的終濃度為35%，充分靜止后收集 沉淀，將所述沉淀重新溶解，得到粗產物；
[0019] 步驟六、利用Ni-NTA親和柱純化所述粗產物，得到所述突變型梅毒檢測抗原；以 及
[0020] 步驟七、對所述突變型梅毒檢測抗原進行標記，使得所述標記物標記在所述突變 型梅毒檢測抗原的N端或C端的賴氨酸位點，得到所述綴合物。
[0021] 在一個實施例中，所述突變型梅毒檢測抗原由梅毒螺旋體抗原中間的1或2個賴 氨酸突變為甘氨酸后得到。
[0022] 在一個實施例中，所述用于表達突變型梅毒檢測抗原的基因表達序列包括：
[0023] (a)、SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列；
[0024] (b)、與SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列具有至少98%同源性的核苷酸序列；或
[0025] (c)、SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列，其中一個或多個堿基被缺失、替代或增加得 到的核苷酸序列。
[0026] -種梅毒檢測試劑，包括上述的綴合物。
[0027] -種梅毒檢測試劑盒，包括上述的梅毒檢測試劑。
[0028] 在一個實施例中，還包括包被抗原包被的酶聯板、洗滌液、顯色液、終止液、樣品稀 釋液、陰性對照品和陽性標準品；
[0029] 所述包被抗原包括：
[0030](a)、由SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸編碼得到的多肽；
[0031] (b)、與SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸具有至少98%同源性的多 核苷酸編碼得到的多肽；或
[0032] (c)、由SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸，其中一個或多個堿基被 缺失、替代或增加得到的多核苷酸編碼得到的多肽。
[0033] 這種綴合物，包括突變型梅毒檢測抗原和標記物，通過對梅毒檢測抗原基因突變， 使梅毒檢測抗原中間的1或2個賴氨酸突變，梅毒檢測抗原中間容易與標記物結合的賴氨 酸變成其它的氨基酸，使得標記物標記在突變型梅毒檢測抗原的N端或C端的賴氨酸位點， 而不與中間部分的氨基酸結合，從而避免了抗原活性位點被標記物包裹。與傳統的試劑相 比，該綴合物的抗原活性位點不會被標記物包裹，避免了抗原決定簇與標記物結合造成的 抗原活性降低，從而不影響抗原活性，該綴合物用于梅毒檢測時，可提高檢測的靈敏度和特 異性，并且可以避免前帶現象。
【附圖說明】
[0034] 圖1為一實施方式的綴合物的制備方法的流程圖；
[0035] 圖2為實施例3中突變型梅毒檢測抗原重組質粒的制備過程的示意圖。
【具體實施方式】
[0036] 下面主要結合附圖及具體實施例對綴合物及其制備方法和應用做進一步的解釋 說明。
[0037] 本發明中使用的術語除非另有說明，否則具有以下含義：
[0038] 綴合物
[0039] 本發明中使用的術語"綴合物"包括突變型梅毒檢測抗原和標記物，突變型梅毒檢 測抗原中間的一個或多個賴氨酸被突變，標記物標記在突變型梅毒檢測抗原的N端或C端 的賴氨酸位點。
[0040] 標記物
[0041] 本發明中使用的術語"標記物"是指免疫檢測中可被檢測到的物質，具體的，標記 物可以為酶、化學發光物質、熒光物質、放射性物質、膠體中的至少一種。
[0042] 在傳統的免疫檢測時，標記物為酶、發光物質、放射性物質等小標記物時，檢測抗 原容易被標記物包裹，經常發生抗原表位被包埋而導致抗原活性降低。本發明發現，通過基 因突變，使梅毒檢測抗原中間的一個或多個賴氨酸發生改變，可使得標記物標記在抗原的N 端和C端的賴氨酸位點，而不與中間部分的氨基酸結合，可以有效的解決上述問題。
[0043] 因此，本發明提供一種綴合物，包括突變型梅毒檢測抗原和標記物，其中，突變型 梅毒檢測抗原由梅毒螺旋體抗原中間的1或2個賴氨酸突變后得到，標記物標記在突變型 梅毒檢測抗原的N端或C端的賴氣酸位點。
[0044] 梅毒檢測抗原由梅毒螺旋體抗原中間的1或2個賴氨酸突變后得到，容易與標記 物結合的賴氨酸變成其它的氨基酸，使得標記物標記在突變型梅毒檢測抗原的N端或C端 的賴氨酸位點，而不與中間部分的氨基酸結合，從而避免了抗原活性位點被標記物包裹，進 而提高檢測的靈敏度和特異性。
[0045] 具體的，突變型梅毒檢測抗原由梅毒螺旋體抗原中間的1或2個賴氨酸突變成甘 氨酸或其他中性氨基酸后得到。
[0046] 在一個實施方式中，突變型梅毒螺旋體抗原由梅毒螺旋體抗原TpNl5的第69位賴 氨酸和第89位賴氨酸突變成甘氨酸得到。突變型梅毒螺旋體抗原采用如下操作制得：PCR 擴增梅毒螺旋體抗原15Kda(TpN15)基因（GeneBankNo:U73115. 1)的24aa~140aa所對 應的DNA區段。采用片段褡褳的方式用兩對點突變引物分別突變其中第69位賴氨酸及第 89位賴氨酸，上游引物帶有BamHI位點，下游引物帶有EcoRI位點，用BamHI/EcoRI酶切PCR 回收片段，連接到用BamHI和EcoRI雙酶切處理之后的表達載體pET-26b(+)中，轉化后表 達的蛋白命名為TP049,即突變型梅毒螺旋體抗原。TP049即為由SEQIDNo. 1所示的核苷 酸序列組成的多核苷酸編