乙型副傷寒和爪哇變種沙門菌試劑盒、制備及使用方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及沙門菌屬中乙型副傷寒沙門菌和乙型副傷寒爪哇變種沙門菌的鑒定方法，即利用血清診斷結合生化反應鑒定的試劑盒、制備和使用方法。
【背景技術】
[0002]沙門菌是重要的食源性感染性病原菌，在養殖動物和環境中廣泛存在，有近2000多種血清型，其中和人感染有關的亞屬I的沙門菌多數需要依靠血清分型診斷，其中有些血清型的抗原式相同。如:乙型副傷寒沙門菌(4，5，12:13:1^1)和乙型副傷寒爪哇變種沙門菌(4，5，12:13:1^1)兩者具有相同H相抗原，因此不能單純憑借血清學方法鑒別。《中華人民共和國傳染病防治法》對兩者引發疾病的生物危害分級和公共衛生學意義不同:乙型副傷寒沙門菌屬乙類病原菌，可引起類傷寒樣疾病，具有較重要的臨床診斷學和公共衛生意義；爪哇變種沙門菌屬丙類傳染病，可通過糞-口傳播引發食源性感染或者腹瀉的散發或聚集病例，其引發的公共衛生學意義相對較小。長期以來，臨床實驗室和公共衛生實驗室由于兩者在抗原上的相似性而無法鑒別和準確報告鑒定結果，或者因為抗原的誘導試驗而延誤正確的報告時間，直接影響國家傳染病報告系統對乙型副傷寒的精準病例數據和傳染病流行評估。國外的專業實驗室通常使用分子生物學方法(PCR)檢測兩者的d-酒石酸鉀調控子(dt基因，dt陽性者為爪哇變種，dt陰性者為乙型副傷寒)，但該技術需要分子診斷實驗室的配置要求，對大多數國內基層實驗室來說存在應用普及障礙。有鑒于此，我們設計了一種簡易血清配置改良生化試驗組成的試劑盒可滿足臨床、公共衛生和其他農林水產實驗室在常規工作中篩選并鑒別乙型副傷寒沙門菌的技術需要，省時、省力，易于操作，綜合費用低廉，具有很好的社會和經濟效益。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是公開一種即用型乙型副傷寒和爪哇變種沙門菌鑒別診斷試劑盒、制備及使用方法。主要解決在臨床腹瀉病例和環境、食品標本中快速篩選甄別乙型副傷寒沙門菌技術難題。
[0004]本發明的技術方案為:乙型副傷寒沙門菌和乙型副傷寒爪哇變種沙門菌鑒定試劑盒，其特征是:包括
1)、沙門菌B群免疫兔抗血清:含沙門菌0:4、0:5因子抗體的稀釋血清；
2)、沙門菌H相免疫兔抗血清:分別含沙門菌H相b和2因子抗體的稀釋血清；
3)、酒石酸鉀生化鑒別管:蛋白胨10.0g,酒石酸鉀鈉10.0g,氯化鈉5.0g,酚紅0.024g，瓊脂15.0g，蒸饋水1000.0ml ；
4)、滅菌礦物油；
5)、H相專用誘導軟瓊脂:胰大豆胨蛋白胨10.0g，酪蛋白5.0g，硝酸鉀l.0g，瓊脂粉
2.0g,蒸飽水 1000.0ml ；
6)、H相b因子誘導血清:含有誘導血清H:b因子。
[0005]本發明的有益效果是:本發明利用乙型副傷寒不利用酒石酸鉀的生化特性結合抗原初篩結果達到快速、簡單的鑒定效果。標準化配方試劑盒可以可滿足臨床、公共衛生和其他農林水產實驗室在常規工作中篩選并鑒別乙型副傷寒沙門菌的檢測需要，省時、省力，易于操作，綜合費用低廉，具有很好的社會和經濟效益。
【具體實施方式】
[0006]即用型乙型副傷寒沙門菌和乙型副傷寒爪哇變種沙門菌的鑒定試劑盒，包括:
1、沙門菌B群免疫兔抗血清，組成成分:0:4、0:5。制法:將0:4免疫抗原菌株(里定沙門菌)和0:5免疫抗原菌株(乙型副傷寒沙門菌)接種普通營養瓊脂培養基，經36±1°C培養20h后收集菌苔，用生理鹽水制成適宜濃度的菌液，置100°C水浴中煮沸2.5h，破壞鞭毛抗原后制成無鞭毛菌體抗原，按照第Id (50億菌量)腹腔皮下注射、第3d (100億菌量)耳靜脈注射、第1d (200億菌量)耳靜脈注射、第17d (400億菌量)耳靜脈注射、第24d (800億菌量)耳靜脈注射菌液濃度與時間間隔程序免疫家兔、第25d對家兔行心臟無菌采血或者頸動脈無菌采血術采集兔血，置4°C待血塊凝固收縮后分離血清。粗制的抗O血清需要吸收其他非特異性的抗原。血清吸收除去交叉凝集素:取粗制血清以生理鹽水作10倍稀釋與對應的菌株(按中國生物制品規程標準要求)做玻片凝集試驗，如出現其他類屬凝集素的交叉反應，必須在血清種加入交叉反應相關的吸收菌(吸收)除去這些交叉凝集素。方法:取粗制抗血清，先用5倍的生理鹽水稀釋，然后加入適量已洗滌過的吸收菌(吸收菌抗原制法同前:通常0:4的吸收菌為傷寒沙門菌、0:5的吸收菌為里定和山夫登堡沙門菌)，置36±1°C保溫3h (每隔15min搖勻I次)，取出置4°C冰箱過夜，次日離心分離血清，將血清稀釋10倍，并用交叉凝集菌株作玻片凝集試驗檢定。一次吸收不盡時，可以多次吸收，直至不出現交叉凝集。一般需要吸收多次才能制成。試劑盒配置血清分裝2ml/瓶，工作稀釋度為1:10。
[0007]2、沙門菌H相免疫兔抗血清，組成成分:H:b、H:2。制法:將H:b免疫抗原菌株(乙型副傷寒爪哇變種沙門菌)和H:2免疫抗原菌株(乙型副傷寒沙門菌)復蘇，單相或者雙相抗原性提供玻片凝集測試達到一定的凝集效價后再接種質量百分含量為0.8%軟瓊脂培養基，36±1°C培養20h后收集菌體，用生理鹽水制成適宜濃度的菌液，加入質量百分濃度為
0.5%甲醛溶液滅活制成免疫用抗原，按照第Id (50億)腹腔皮下注射、第3d (100億)耳靜脈注射、第1d (200億)耳靜脈注射、第17d (400億)耳靜脈注射、第24d (800億)耳靜脈注射菌液濃度和時間間隔免疫家兔、第25d對家兔行心臟無菌采血或者頸動脈無菌采血術采集兔血，置4°C待血塊凝固收縮后分離血清。粗制的抗H因子血清需要吸收其他非特異性的抗原。血清吸收除去交叉凝集素:取粗制血清以生理鹽水作10倍稀釋與對應的菌株(按中國生物制品規程標準要求)做玻片凝集試驗，如出現其他類屬凝集素的交叉反應，必須在血清種加入交叉反應相關的吸收菌(吸收)除去這些交叉凝集素。方法:取粗制抗血清，先用5倍的生理鹽水稀釋，然后加入適量已洗滌過的吸收菌(吸收菌抗原制法同前:通常H:b的吸收菌為鼠傷寒沙門菌、H: 2的吸收菌為乙型副傷寒爪哇變種和湯卜遜沙門菌)，置36± I°C保溫3h(每隔15min搖勻I次)，取出置4°C冰箱過夜，次日離心分離血清，將血清稀釋10倍，并用交叉凝集菌株作玻片凝集試驗檢定。一次吸收不盡時，可以多次吸收，直至不出現交叉凝集。一般需要吸收多次才能制成。試劑盒配置血清分裝2ml/瓶，工作稀釋度為1:10。
[0008]3、酒石酸鉀生化鑒別管，成分:蛋白胨10.0g，酒石酸鉀鈉10.0g，氯化鈉5.0g，酚紅0.024g，瓊脂15.0g,蒸餾水1000.0ml。制法:將上述成分(除酚紅外)混合，加熱溶化，調整pH為7.8，加入酚紅過濾后分裝試管，每管約10.0ml，于115°C 20min滅菌，直立冷卻。
[0009]4、滅菌礦物油，成分:礦物油1ml分裝后置100°C烘烤2h。使用方法:用接種環或者接種針挑取純