一種利用中藥特征圖譜區別道地藥材黃山貢菊與偽品七月菊的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及利用中藥特征圖譜作為區別道地藥材黃山貢菊與偽品七月菊，尤其是 道地藥材黃山貢菊與偽品七月菊的鑒別除偽方法，初步建立了貢菊、七月菊及兩種菊花間 指紋圖譜的共有模式，以及主要峰相對保留時間和相對峰面積的RSD范圍，為黃山貢菊的 道地性提供了一定的理論依據。
【背景技術】
[0002] 貢菊為菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat?的干燥頭狀花序，10~11 月花盛開時分批采收，陰干或烘干，主產于黃山歙縣地區，目前均為栽培品。同樣主產于歙 縣的七月菊為黃山貢菊的變異品種，花期較長，7月至9月底均能采摘，因其形似黃山貢菊 而花期較早，產量較大，在市場中常做為黃山貢菊的混淆品。單靠外觀經驗鑒別不易鑒別出 干燥的黃山貢菊和七月菊，目前七月菊常被干燥后混于黃山貢菊中，以次充好，而干燥后的 七月菊與黃山貢菊較為相似，外觀上不易鑒別。中藥材由于受到品種、采收時間、貯存、炮制 工藝等因素的制約，加上產地較多，規格等級復雜，各地方標準對同種藥材炮制加工工藝也 不一致，因此在功效、作用上存在一定的差異性。故僅憑單一指標性成分很難全面客觀的反 映中藥材的內在質量。目前，中藥特征圖譜作為中藥這一復雜樣品體系質量控制的技術手 段，已在國內外獲得了廣泛認可并發展迅速。其誕生于生產實踐，具有實用性和通用性，是 全面反映中藥材內在質量的強有力的技術手段。本專利通過對不同產地、加工方法來源的 貢菊、七月菊藥材進行色譜圖分析比較，確立它們的共有峰，從而為道地藥材黃山貢菊的質 量評價體系研究提供科學的實驗依據，從內在質量上來鑒別七月菊與黃山貢菊。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供一種利用中藥特征圖譜區別道地藥材黃山貢菊與偽品七 月菊的方法，本發明方法高效，結果客觀，精密可靠，能夠彌補外觀鑒別方法不夠客觀的缺 陷，從內在質量上區別二者，避免了感官判斷的主觀性，為黃山貢菊的道地性提供了一定的 理論依據，利于保護道地藥材黃山貢菊品質，適應國家對道地藥材發展的要求。
[0004] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0005] -種利用中藥特征圖譜區別道地藥材黃山貢菊與偽品七月菊的方法，包括以下步 驟：
[0006] (1)對照品溶液的制備
[0007] 精密稱取維生素A對照品10. 44mg，置10ml棕色量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻 度，搖勻，作為儲備液；精密量取lml置50ml棕色量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為 對照品溶液；
[0008] ⑵供試品溶液的制備
[0009] 稱取貢菊、七月菊樣品各5g，用C02超臨界萃取儀萃取1小時，提取液用旋蒸儀旋 干，用正己烷定容至10ml，0. 45 y m濾膜濾過，取續濾液進行分析。整個過程避光操作；
[0010] ⑶方法學考察
[0011] 在HPLC-UV色譜圖中，選擇維生素A為參照峰，各成分峰相對于維生素A的峰面積 之比（RPA)，可按下列公式計算：
[0012] RPA = Ai/Ar
[0013] 其中Ai =特征峰峰面積；
[0014] Ar =指標成分峰峰面積（維生素A);
[0015] 樣品中特征峰的相對保留時間（RRT)可按下列公式計算：
[0016] RRT = RTi/RTr
[0017] 其中RTi=特征峰保留時間；
[0018] RTr =指標成分峰保留時間（維生素A);
[0019] ①精密度試驗
[0020] 精密吸取貢菊供試品溶液10ul，按色譜條件，連續進樣6針，以維生素A作為參照 峰，指定其a值為1.000,考察儀器的精密度。
[0021] ②穩定性試驗
[0022] 精密吸取同一貢菊供試品溶液10 y L，按色譜條件，分別在0h、2h、4h、8h、12h、24h 進樣檢測，以維生素A (峰1)作為參照峰，指定其a值為1. 000,考察貢菊供試品溶液的穩 定性。
[0023] ③重復性試驗
[0024] 取同一貢菊藥材樣品6份，每份稱取貢菊樣品5g，用C02超臨界萃取儀（超臨界 條件：溫度：35°C ;壓力：250bar ;夾帶劑：無水乙醇；比例：10% ;分離壓lObar ;旋蒸儀條 件：溫度：45°C，壓力：120pa。）萃取1小時，提取液用旋蒸儀旋干，用正己烷定容至10ml， 0. 45 ym濾膜濾過，取續濾液進行分析。整個過程避光操作。進行6次獨立的供試液溶液的 制備，按色譜條件進行測定，以維生素A (峰1)作為參照峰，指定其a值為1. 000,考察方法 的重復性。
[0025] 步驟⑵中所述超臨界條件：溫度35°C，壓力250bar，夾帶劑無水乙醇，比例 1〇%，分離壓1(^31' ;所述旋蒸儀條件：溫度45<€，壓力120口3。
[0026] 步驟（3)精密度試驗、穩定性試驗和重復性試驗中所述色譜條件為：色譜柱： Phenomenex Luna silica(2) (250X4. 6mm，5 ym);流動相：正己燒（A)和異丙醇（B) (99. 7 : 〇.3v/v)，柱溫30°C，進樣體積為20yL，檢測器為二極管陣列檢測器（DAD)或紫外檢測器 (UV)，檢測波長為325nm，流速：1.0ml/min，洗脫時間為45分鐘。
[0027] 本發明通過正相高效液相色譜技術建立了貢菊與七月菊色譜指紋圖譜，該方法能 使菊花SFC提取的極性較小的化學成分得到較好的分離，具有很好的穩定性、重現性，同時 進行了這兩種菊花之間的比較，通過實驗發現：
[0028] (1)菊花樣品組內相似性極高，說明同一品種菊花群體特征具有一致性；而組間 相似度低于〇. 8,說明不同品種菊花種屬間存在一定的差異；
[0029] (2)不同品種菊花藥材極性小化學成分種類上稍有差別，其中貢菊在7. 7min及 14. 5min有兩個特征峰，而七月菊在39. 5min左右時有一個特征峰，但主要成分含量上差 異較大。據調查分析可能與生長環境、采摘時間、品種、加工方法以及儲存方法等有相關聯 系；
[0030] (3)根據已知信息及分析結果相結合，初步建立了貢菊、七月菊及兩種菊花間指紋 圖譜的共有模式，以及主要峰相對保留時間和相對峰面積的RSD范圍，為黃山貢菊的道地 性提供了一定的理論依據。
[0031] 本發明方法高效，結果客觀，精密可靠，能夠彌補外觀鑒別方法不夠客觀的缺陷， 從內在質量上區別二者，避免了感官判斷的主觀性，為黃山貢菊的道地性提供了一定的理 論依據，利于保護道地藥材黃山貢菊品質，適應國家對道地藥材發展的要求。
【附圖說明】
[0032] 圖1為8批貢菊藥材特征圖譜及其共有模式；
[0033] 圖2為8批七月菊藥材特征圖譜及其共有模式；
[0034] 圖3為8批貢菊與8批七月菊藥材特征圖譜及其共有模式。
【具體實施方式】
[0035] 1、實驗儀器、試劑與材料
[0036] 儀器：Thar C02超臨界萃取儀（德祥科技有限公司），Laborta 4001 efficien 旋轉蒸發儀（德國Heidolph公司），All分析研磨機（IKA公司），電子分析天平（BS210S 德國，Sartorius)，高效液相色譜儀（LC-20AD型，日本島津）。材料：Phenomenex Luna silica (2) (250X4. 6mm，5 y )、8批貢菊、8批七月菊藥材樣品、維生素A對照品（中檢院，供 含量測定用，批號：100368-201301。lg含維生素A醋酸酯343mg其中含反式維生素A醋酸 酯96. 9% )。無水乙醇為分析純，水為超純水；正己燒、異丙醇為色譜純。
[0037] 2、色譜條件
[0038] 采用日本島津LC-20AD高效液相色譜儀，色譜柱：Phenomenex Luna silica (2) (250X4. 6mm，5ym);流動相：正己烷⑷和異丙醇⑶（99. 7 :0. 3v/v)，柱溫30°C，進樣體 積為20 yL，檢測器為二極管陣列檢測器（DAD)或紫外檢測器（UV)，檢測波長為325nm，流 速：1. 0ml/min，洗脫時間為45分鐘。
[0039] 3、對照品溶液的制備
[0040] 精密稱取維生素A對照品10. 44mg，置10ml棕色量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻 度，搖勻，作為儲備液；精密量取lml置50ml棕色量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為 對照品溶液。
[0041] 4、供試品溶液的制備
[0042] 稱取貢菊、七月菊樣品各5g，用C02超臨界萃取儀（超臨界條件：溫度：35°C ;壓 力：250bar ;夾帶劑：無水乙醇；比例：10% ;分離壓10bar ;旋蒸儀條件：溫度：45°C，壓力： 120pa。）萃取1小時，提取液用旋蒸儀旋干，用正己燒定容至10ml，0. 45 ym濾膜濾過，取續 濾液進行分析，整個過程避光操作。
[0043] 5、方法學考察
[0044] 在HPLC-UV色譜圖中，選擇維生素A為參照峰，各成分峰相對于維生素A的峰面積 之比（RPA)，可按下列公式計算：
[0045] RPA = Ai/Ar
[0046] 其中Ai =特征峰峰面積；
[0047] Ar =指標成分峰峰面積（維生素A);
[0048] 樣品中特征峰的相對保留時間（RRT)可按下列公式計算：
[0049] RRT = RTi/RTr
[0050] 其中RTi =特征峰保留時間；
[0051] RTr =指標成分峰保留時間（維生素A);
[0052] 5. 1精密度試驗
[0053] 精密吸取貢菊供試品溶液10ul，按上述色譜條件，連續進樣6針，以維生素A(峰 1)作為參照峰，指定其a值為1. 000,考察儀器的精密度。結果各峰的相對保留時間的RSD 在0. 11-0. 44%之間，相對峰面積的RSD在0. 34-1. 75%之間，表明儀器的精密度良好。結 果見表1、2。
[0054] 表1貢菊特征圖譜精密度實驗結果（相對保留時間）
[0055]
[0056] 表