檢測scml2的即用型快速酶免疫組織化學試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫學生物技術領域，具體涉及檢測SCML2的即用型快速酶免疫組織化學試劑盒。
【背景技術】
[0002]SCML2是Montini等于1999年首先在果蠅的SCM基因Xp22染色體被鑒定出來，總長約15Kb，在C端為高度保守內含子和外顯子的結構。SCML2在哺乳動物廣泛表達并且編碼一個700個氨基酸的蛋白。SCML2是多梳基因家族的一個成員，多梳家族基因編碼一組染色體結合蛋白，研宄表明它在胚胎發育過程中起到關鍵作用，它能抑制trxG蛋白對胚胎發育的活化作用。大多數的哺乳動物的多梳家族基因與果蠅同源，敲除老鼠的多梳家族基因，老鼠出現造血缺陷、神經嵴缺陷、心臟畸形。SCML2可能與HOX基因轉錄抑制有關，而后者的突變可導致發育畸形；并且SCML2與多疏蛋白抑制復合體的調節有關，后者與維持抑制和阻止染色體重塑有關，同時它在調控胚胎發育的同源基因中起著重要作用。近來部分臨床研宄資料也證實多梳家族基因與細胞增殖和腫瘤形成的調控有關，SCML2可在急性髓細胞白血病過度表達，進一步佐證其在細胞分化和細胞周期調控中起重要作用。
[0003]我們運用自建的SCML2即用型快速酶免疫組織化學試劑盒檢測發現SCML2在人神經內分泌腫瘤組織中呈現高表達，并且它的表達水平與神經內分泌腫瘤的病理類型、病理分級、侵潤深度及分期相關。我們的研宄進一步發現，神經內分泌腫瘤中SCML2表達陽性率為90.6%，而癌旁組織及其他類型腫瘤中均不表達，差異有統計學意義，提示SCML2可能在神經內分泌腫瘤發生發展過程中起著較重要作用，且為神經內分泌腫瘤特異性診斷標志物。
[0004]快速酶免疫組織化學法與一般的免疫組化法比較，有以下幾點優勢:①快速酶免疫組織化學法將二抗和酶聯接成一個多聚體，可直接放大信號40?50倍，再與已經結合的一抗反應，最后顯色劑顯色，大大提高了檢測敏感性及定位性；?快速酶免疫組織化學法所使用的多聚物在組織中不含有，減少了非特異性背景；③快速酶免疫組織化學法以酶代替生物素與二抗連接，從而避免了組織中生物素的干擾；④快速酶免疫組織化學法染色步驟為兩步，且第二抗體孵育時較短，比較省時。
[0005]本發明建立快速酶免疫組織化學法檢測人組織標本中SCML2，該方法具有簡易、快捷、靈敏、通用、重現性好的特點，為臨床病理組織標本中SCML2的檢測提供了良好的平臺。
[0006]目前，國際上還沒有相關報道，更沒有專門用于檢測SCML2的即用型快速酶免疫組織化學試劑盒提供，因此，該試劑盒的開發和應用，填補了這方面的空白。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種簡易、快捷、靈敏、通用、重現性好的即用型快速酶免疫組織化學試劑盒，以此來確定人組織樣本中SCML2抗原的表達水平和細胞定位情況。
[0008]為解決上述技術問題，本發明的技術方案是:檢測SCML2的即用型快速酶免疫組織化學試劑盒，其創新點在于:有盒體，盒體中包括以下容器:
(1)3%H202去離子水容器；
(2)粉劑型抗原修復液容器；
(3)粉劑型磷酸鹽緩沖液容器；
(4)單克隆小鼠抗人SCML2抗體容器；
(5)聚合物增強劑容器；
(6)HRP酶標抗鼠IgG聚合物容器；
(7)二氨基聯苯胺容器。
[0009]進一步的，所述盒體中試劑成分包括:
(1)3%H202去離子水容器中的試劑成分為3%H 202;
(2)粉劑型抗原修復液容器中的試劑成分為粉劑型抗原修復液；
(3)粉劑型磷酸鹽緩沖液容器中的試劑成分為粉劑型磷酸鹽緩沖液；
(4)單克隆小鼠抗人SCML2抗體容器中的試劑成分為單克隆小鼠抗人SCML2抗體，儲存濃度為0.2 μ g/ μ I ；
(5)聚合物增強劑容器中的試劑成分為聚合物增強劑；
(6)HRP酶標抗鼠IgG聚合物容器中的試劑成分為HRP酶標抗鼠IgG聚合物；
(7)二氨基聯苯胺容器中的試劑成分為二氨基聯苯胺。
[0010]進一步的，所述使用方法包括以下步驟:
(1)切片和烤片:石蠟包埋組織5μπι連續切片，貼于載玻片上，在電熱恒溫干燥箱內烘片I h，所述烘片溫度為67°C ;
(2)脫蠟、水化組織切片:二甲苯5minX2次一無水乙醇5 minX I次一95%乙醇5minX I次一80%乙醇5 min — 70%乙醇5 min —自來水沖洗片刻一0.01 mol/L PBS沖洗I min X 3 次；
(3)阻斷內源性過氧化物酶:每張切片滴加I滴3%H2O2，室溫10 min,0.01 mol/L PBS沖洗3 minX3次；
(4)抗原修復:高壓鍋內加適量的水置電磁爐上煮沸，將切片浸入裝有抗原修復液的瓷缸中，所述抗原修復液的成分為0.01 mol/L檸檬酸緩沖液，所述檸檬酸緩沖液的pH為6.0，放入高壓鍋內，加熱至噴氣，維持3 min ;取出瓷缸使修復液自然冷卻至室溫，0.01 mol/LPBS 沖洗 3 minX3 次;
(5)一抗反應:甩去切片上的血清，滴加1:100稀釋的單克隆小鼠抗人SCML2抗體，室溫孵育 2 h ；0.01 mol/L PBS 沖洗 3 minX 3 次。
[0011](6)滴加聚合物增強劑:擦去多余水分，滴加I滴聚合物增強劑，室溫孵育20 min ；0.01 mol/L PBS 沖洗 3 minX3 次;
(7)二抗反應:甩去多余水分，滴加I滴HRP酶標抗鼠IgG聚合物，室溫孵育30 min,0.01mol/L PBS 沖洗 3minX3 次；
(8)顯色:除去PBS液，每張切片滴加I滴新鮮配制的二氨基聯苯胺工作液，同時在顯微鏡下觀察控制顯色程度，待出現陽性反應，則置流水下沖洗及時終止反應；
(9)襯染:蘇木素復染30s?2min，流水沖洗，1%鹽酸-乙醇分化，流水沖洗； (10)脫水:70%乙醇3min — 80%乙醇3 min — 95%乙醇3 min —無水乙醇3 min —二甲苯3 minX2次；
(11)封片:中性樹脂封固；
(12)顯微鏡下觀察確定SCML2抗原的表達水平和細胞定位情況。
[0012]本發明的有益效果如下:
(I)本試劑盒將快速酶免疫組織化學檢測過程中所用試劑集中到一個盒體中，無需各實驗室自行分別購置及稱量配制，減少了實驗人員的工作量、不同試劑誤差及配制誤差。其特征是:有盒體，盒體中裝有3% H2O2去離子水容器、粉劑型抗原修復液容器及粉劑型磷酸鹽緩沖液，還裝有單克隆小鼠抗人SCML2抗體容器、聚合物增強劑容器、HRP酶標抗鼠IgG聚合物容器及二氨基聯苯胺容器，其有益效果為:大大簡化了檢測操作過程，并能保證檢測結果有良好的質控。
[0013](2)本試劑盒將抗鼠IgG和酶聯接成一個多聚體，可直接放大信號40-50倍，再與已經結合的單克隆小鼠抗人SCML2抗體反應，最后顯色劑顯色，大大提高了檢測敏感性及定位性；本試劑盒所使用的多聚物在組織中不含有，減少了非特異性背景；本試劑盒以酶代替生物素與抗鼠IgG連接，從而避免了組織中生物素的干擾；本試劑盒染色步驟為兩步，且第二抗體孵育時較短，比較省時，最后顯微鏡下觀察確定SCML2抗原的表達水平和細胞定位情況，這是該試劑盒的一個顯著特色和創新。
[0014](3)本發明還具有簡易、快捷、靈敏、通用、重現性好、成本低的特點。
【附圖說明】
[0015]圖1為檢測SCML2的即用型快速酶免疫組織化學試劑盒組成示意圖。
【具體實施方式】
[0016]1、3% H2O2去離子水容器，2、粉劑型抗原修復液容器，3,HRP酶標抗鼠IgG聚合物容器，4、二氨基聯苯胺容器，5、單克隆小鼠抗人SCML2抗體容器，6、聚合物增強劑容器，7、粉劑型磷酸鹽緩沖液容器，8、盒體
以下由特定的具體實施例說明本發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點及功效。
[0017]本發明中有盒體8，盒體8中包括以下容器:
(1)3%H202去離子水容器I ;
(2)粉劑型抗原修復液容器2;<