果斑病菌免疫膠體金檢測試紙條及其單抗和雜交瘤細胞株的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程領域，尤其涉及一種瓜類細菌性果斑病菌，具體來說是一種 瓜類細菌性果斑病菌免疫膠體金快速檢測試紙條及其單抗和雜交瘤細胞株。
【背景技術】
[0002] 瓜類果斑病是一種嚴重的細菌性病害，20世紀80年代后期該病因在美國數個 州的西瓜上出現破壞性爆發而受到廣泛關注，自此，瓜類細菌性果斑病在世界范圍內傳播 開來。其病原為革蘭氏陰性菌的嗜酸菌屬燕麥種西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp. citrulli，Aac)，是一種具有高度破壞性的種傳病菌。到目前為止，并無可以完全抵抗該病 菌的商業化的培育品種。
[0003] 瓜類果斑病菌又稱果斑病菌，它可以引起西瓜、甜瓜、南瓜等萌蘆科植物患病，據 報道，在番茄、茄子等茄科植物的種子中也檢測到了該病原菌，它可侵染果實、植株及種子， 主要依靠帶菌種子傳播。帶菌種子播種后會使幼苗患病，出現褐色壞死斑。帶菌果實在采 后貯藏運輸過程中會感染健康果實，表面會出現水漬狀斑點，最終導致整個果實腐爛，嚴重 影響瓜類產量。
[0004] 目前市場上用于檢測果斑病菌的試紙是來自美國Agdia公司，國內報道較少，且 現有技術中的免疫膠體金試紙條所使用的抗體往往是使用單克隆抗體作為金標抗體和多 克隆抗體作為檢測抗體配合使用，因此存在著檢測精度低和交叉反應高、試紙條有效期短 等問題，對檢測的精度和準確度造成了一些影響。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術中的上述技術問題，本發明提供了一種瓜類細菌性果斑病菌免疫膠 體金快速檢測試紙條，所述的這種瓜類細菌性果斑病菌免疫膠體金快速檢測試紙條解決了 現有技術中的試紙條檢測瓜類細菌性果斑病菌靈敏度不高的技術問題。
[0006] 本發明提供了一種瓜類細菌性果斑病菌免疫膠體金快速檢測試紙條，包括樣品 墊、緊密連接于所述樣品墊的金標墊、所述的金標墊上與所述金標墊緊密連接的纖維素膜 和緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊，所述的纖維素膜上遠離金標墊的一端設置 質控線，在質控線和金標墊之間的纖維素膜上設置檢測線，其中，在所述的金標墊上設置 有與膠體金耦聯的單克隆抗體，所述的單克隆抗體由保藏號為CGMCC NO. 10413的雜交瘤 細胞株分泌產生，所述的檢測線由單克隆抗體構成，所述的單克隆抗體由保藏號為CGMCC NO. 10413的雜交瘤細胞株分泌產生。
[0007] 進一步的，所述的質控線由羊抗鼠抗體組成。
[0008] 進一步的，在所述的膠體金耦聯的單克隆抗體中，單克隆抗體與膠體金在質量體 積比為24 y g: lmL。
[0009] 進一步的，所述的試紙條背面可設置一個起支撐作用的背板。
[0010] 進一步的，所述的試紙條裝入一個盒體中，所述的盒體對應于樣品墊的部位設有 檢測孔，對應于檢測線和質控線的部位設有觀測窗。
[0011] 本發明還提供了一種單克隆抗體，由保藏號為CGMCC NO. 10413的雜交瘤細胞株分 泌產生。
[0012] 本發明還提供了一種雜交瘤細胞株，其保藏號為CGMCC NO. 10413。
[0013] 本發明的一種雜交瘤細胞株，分類命名：抗瓜類細菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrullii)雜交瘤細胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心（CGMCC)中，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的地址為：北京市 朝陽區北辰西路1號院（中科院微生物研宄所），保藏日期為2015年3月19日，保藏號為 CGMCC NO. 10413。
[0014] 本發明的檢測原理與結果判斷過程為：若樣本中有待測細菌，測定時樣品處理液 加在樣品墊上，樣品處理液按樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊的方向移動，流經金標 墊時，使金標墊上的與膠體金耦聯的單克隆抗體復溶，并帶動其向硝酸纖維素膜、吸水墊移 動，與膠體金耦聯的單克隆抗體可與樣品中的細菌結合，形成免疫復合物，此免疫復合物流 至檢測線時，即被檢測線的單克隆抗體所捕獲，形成細菌+金標抗體+抗體的復合體，在硝 酸纖維素膜上的檢測線位置顯出紅色檢測線條；此免疫復合物流經質控線時，即被質控線 的固相抗體所捕獲，在硝酸纖維素膜上的質控線位置顯出紅色質控線條。
[0015] 陽性標本既顯示檢測線，又顯示質控線；陰性標本沒有檢測線，僅顯示質控線。
[0016] 本發明人的研宄表明，以西瓜斑菌菌株作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，分離純化 得到保藏號為CGMCC NO. 10413的雜交瘤細胞株，純化后的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體 的效價可達到1:12800,其能夠特異性、高效地與8種西瓜斑菌菌株結合，與3種Aac近緣植 物病原菌均無交叉反應。
[0017] 本發明和已有技術相比較，其技術進步是顯著的。本發明的果斑病菌的免疫膠體 金檢測試紙條，由于采用了新篩選的配對單克隆抗體分別噴涂金標墊和檢測線，實驗結果 表明，對果斑病菌的檢測特異性和靈敏性均較高。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發明實施例中果斑病菌的免疫膠體金檢測試紙條的單抗SDS-PAGE電泳 圖。
[0019] 圖2是本發明實施例中果斑病菌的免疫膠體金檢測試紙條的腹水及純化后抗體 效價，其中2A表示腹水抗體的效價，2B表示純化后抗體的效價。
[0020] 圖3是本發明實施例中果斑病菌的免疫膠體金檢測試紙條的各抗體偶聯膠體金 pH結果。
[0021] 圖4是本發明實施例中果斑病菌的免疫膠體金檢測試紙條的各抗體偶聯膠體金 結合量結果。
[0022] 圖5是本發明實施例中果斑病菌的免疫膠體金檢測試紙條的結構示意圖。
[0023] 圖6是本發明實施例中果斑病菌的免疫膠體金檢測試紙條的各抗體組合配對結 果。
[0024] 圖7是本發明實施例中果斑病菌的免疫膠體金檢測試紙條的膠體金試紙條靈敏 度結果。
[0025] 圖8是本發明實施例中果斑病菌的免疫膠體金檢測試紙條的膠體金試紙條檢測8 種果斑病菌及交叉反應結果，其中8a表示試紙條檢測8種果斑病菌的檢測結果，8b表示試 紙條檢測3種Aac近緣植物病原菌的檢測結果。
【具體實施方式】
[0026] 以下結合附圖介紹本發明的【具體實施方式】：
[0027] 首先介紹本發明實施例中所使用的試劑與儀器：
[0028] 主要試劑：
[0029] PEG、TWEEN-20來自Sigma ;BSA來自上海世澤生物科技有限公司；膠體金溶液來自 上海金標生物科技有限公司；硝酸纖維素膜（NC膜）135S來自Millipore ;羊抗鼠、HRP-羊 抗鼠、羊抗兔來自生工生物工程股份有限公司。
[0030] 主要儀器：
[0031] 酶標儀SpectraMaxM2 購自MolecularDevices;Nanodrop2000C購自Thermo Scientific;點樣儀AD6010購自BIO-DOT;掃描儀PhantomV9購自MICROTEK;恒溫培養搖 床SPH-100B購自上海世平；蛋白純化儀BioLogic?LP358BR5057購自BIO-RAD;單人凈化 工作臺SW-SJ-2D型購自蘇州凈化。
[0032] 實施例1果斑病菌單克隆抗體制備
[0033] 1.免疫原準備
[0034] 8種西瓜斑菌菌株先在腦心浸液液體培養基進行增菌培養，后在其固體培養基劃 線，挑單菌落于腦心浸液液體培養基中培養后進行PCR鑒定，并測定600nm處0D值，選取生 長較快一株作為免疫菌株。滅菌生理鹽水離心重懸3次，并調整菌濃度為10 8CFU/mL。
[0035] 2.單克隆抗體的制備過程
[0036] 1)實驗動物：選3只8周齡，體重20g左右、雌性Balb/c小鼠為實驗動物。
[0037] 2)免疫方法：每只小鼠腹腔注射0. 4mL免疫原，每間隔2周用同樣劑量加強注射 一次。
[0038] 3)采血：3次加強免疫后從尾部靜脈采血，采用間接非競爭酶聯免疫法測定抗血 清效價。待效價不再上升，腹腔注射同樣量免疫原，3天后按照常規方法進行細胞融合。
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