Lc-ms測試物中不揮發性緩沖鹽含量的降低方法
【技術領域】
[0001] 本申請屬于分析化學技術領域，涉及一種液相色譜-質譜法中的相關操作，特別 是涉及一種用于降低液相色譜-質譜（LC-MS)法測試物中緩沖鹽含量的方法。本申請方法 可以有效地降低高效液相色譜洗脫液中的緩沖鹽含量，從而使得該洗脫液在用于后續的質 譜測定時減少對質譜儀的損耗。本發明采用簡單的處理方法，可以實現LC-MS法的LC洗脫 餾份中不揮發性緩沖鹽濃度的大大降低，并且目標物質不會損耗。
【背景技術】
[0002] 質譜分析是一種測量離子質荷比（質量-電荷比）的分析方法，其基本原理是使 試樣中各組分在離子源中發生電離，生成不同荷質比的帶電荷的離子，經加速電場的作用， 形成離子束，進入質量分析器。在質量分析器中，再利用電場和磁場使發生相反的速度色 散，將它們分別聚焦而得到質譜圖，從而確定其質量。
[0003] 質譜技術是一種鑒定技術，在有機分子的鑒定方面發揮非常重要的作用。它能快 速而極為準確地測定生物大分子的分子量，使蛋白質組研宄從蛋白質鑒定深入到高級結構 研宄以及各種蛋白質之間的相互作用研宄。
[0004] 隨著質譜技術的發展，質譜技術的應用領域也越來越廣。由于質譜分析具有靈敏 度高，樣品用量少，分析速度快，分離和鑒定同時進行等優點，因此，質譜技術廣泛的應用于 化學，化工，環境，能源，醫藥，運動醫學，刑事科學技術，生命科學，材料科學等各個領域。
[0005] 質譜儀種類繁多，不同儀器應用特點也不同，一般來說，在300°C左右能汽化的樣 品，可以優先考慮用氣相色譜-質譜（GC-MS)進行分析，因為GC-MS使用EI源，得到的質譜 信息多，可以進行庫檢索。毛細管柱的分離效果也好。如果在300°C左右不能汽化，則需要 用LC-MS分析，此時主要得分子量信息，如果是串聯質譜，還可以得一些結構信息。如果是 生物大分子，主要利用LC-MS和MALDI-TOF分析，主要得分子量信息。對于蛋白質樣品，還 可以測定氨基酸序列。質譜儀的分辨率是一項重要技術指標，高分辨質譜儀可以提供化合 物組成式，這對于結構測定是非常重要的。雙聚焦質譜儀，傅立葉變換質譜儀，帶反射器的 飛行時間質譜儀等都具有高分辨功能。
[0006] 質譜分析法對樣品有一定的要求。進行GC-MS分析的樣品應是有機溶液，水溶液 中的有機物一般不能測定，須進行萃取分離變為有機溶液，或采用頂空進樣技術。有些化合 物極性太強，在加熱過程中易分解，例如有機酸類化合物，此時可以進行酯化處理，將酸變 為酯再進行GC-MS分析，由分析結果可以推測酸的結構。如果樣品不能汽化也不能酯化，那 就只能進行LC-MS分析了。對于極性樣品，一般采用ESI源，對于非極性樣品，采用APCI源。
[0007] 液相色譜-質譜聯用儀（liquid Chromatograph Mass Spectrometer)，簡稱 LC-MS，是液相色譜與質譜聯用的儀器。它結合了液相色譜儀有效分離熱不穩性及高沸點化 合物的分離能力與質譜儀很強的組分鑒定能力。是一種分離分析復雜有機混合物的有效手 段。
[0008] 色譜-質譜聯用技術是當代最重要的分離和鑒定的分析方法之一。色譜的優勢在 于分離，色譜的分離能力為混合物分離提供了最有效的選擇，但色譜方法難以得到結構信 息，其主要靠與標樣對比達到對未知物結構的推定；在對復雜混合未知物的結構分析方面 顯得薄弱；在常規的紫外檢測器上對于無紫外吸收化合物的檢測和大量未知化合物的定性 分析還需依賴于其他手段。質譜法能提供豐富的結構信息，用樣量又是幾種譜學方法中用 量最少的，但其樣品需經預處理（純化、分離），程序復雜、耗時長。長期以來，人們為解決這 兩種技術的弱點發展了許多技術，其中色譜-質譜聯用技術是最具發展和應用前景的技術 之一。目前應用較多的是氣相色譜-質譜（GC-MS)聯用。但是GC要求樣品具有一定的蒸 氣壓，只有20%的藥品可不經過預先的化學處理而能滿意地用氣相色譜分離，多種情況下 所研宄的藥物需要經過適當的預處理和衍生化，以使之成為易汽化的樣品才能進行GC-MS 分析。而HPLC可分離極性的、離子化的、不易揮發的高分子質量和熱不穩定的化合物，同 時LC-MS聯機彌補了傳統LC檢測器的不足，具有高分離能力，高靈敏度，應用范圍更廣和具 有極強的專屬性等特點，越來越受到人們的重視。據估計已知化合物中約80%的化合物均 為親水性強、揮發性低的有機物，熱不穩定化合物及生物大分子，這些化合物廣泛存在于當 前應用和發展最廣泛、最有潛力的領域，包括生物、醫藥、化工和環境等方面，它們需要用LC 分離。因此，LC與MS的聯用可以解決GC-MS無法解決的問題。
[0009] 液相色譜-質譜聯用儀是液相色譜與質譜聯用的儀器。它結合了液相色譜儀有效 分離熱不穩性及高沸點化合物的分離能力與質譜儀很強的組分鑒定能力。是一種分離分析 復雜有機混合物的有效手段。聯機的關鍵是適用接口的開發，必須在試樣組分進入離子源 前去除溶劑，目前，多采用履帶式加熱傳送帶。
[0010] 液相色譜質譜聯用儀（liquid Chromatograph Mass Spectrometer)，簡稱 LC-MS， 是有機物分析市場中的高端儀器。液相色譜（LC)能夠有效的將有機物待測樣品中的有機 物成分分離開，而質譜（MS)能夠對分開的有機物逐個的分析，得到有機物分子量，結構（在 某些情況下）和濃度（定量分析）的信息。強大的電噴霧電離技術造就了 LC-MS質譜圖十 分簡潔，后期數據處理簡單的特點。LC-MS是有機物分析實驗室，藥物、食品檢驗室，生產過 程控制、質檢等部門必不可少的分析工具。
[0011] 液相色譜質譜聯用儀特點：液相色譜和質譜連接，可以增加額外的分析能力，能夠 準確鑒定和定量像細胞和組織裂解液，血液，血漿，尿液和口腔液等復雜樣品基質中的微量 化合物。高效液相色譜質譜系統（ABSciex Eksigent LC/MS和LC/MS/MS)提供了一些獨 特的優勢，包括：（1)快速分析和流轉所需的最少樣品準備；(2)高靈敏度并結合可分析多 個化合物能力，甚至可以跨越化合物的種類；（3)高精確度，高分辨率鑒定和量化目標分析 物。
[0012] 盡管人們通過液相色譜-質譜聯用解決了諸多分析化學領域的難題，然而，進行 LC-MS分析時，其樣品通常要求是水溶液或甲醇溶液，并且特別地要求液相色譜的流動相中 不應含有或者盡可能少地含有不揮發的鹽。
[0013] 但是，令人遺憾的是，作為液相色譜例如高效液相色譜的流動相，通常需要向其中 添加一些不具揮發的緩沖鹽以獲得優異的色譜分離效果，但是這些包含不具揮發的緩沖鹽 的色譜洗脫餾份在用于接下來的質譜測定時，這些不揮發性緩沖鹽是難以除去或者難以與 色譜洗脫餾份中的目標物分離開的。例如，中國藥典2010年版二部第6頁收載的乙酰谷 酰胺在測定其中的雜質即有關物質時，通過液相色譜法進行分離分析，該液相色譜使用的 流動相中包含磷酸二氫鉀，在此情況下如果要確定其中雜質峰的歸屬或者化學結構的情況 下，使雜質峰色譜餾份導入質譜儀來檢測是有益的，但是雜質峰色譜餾份中所包含的磷酸 二氫鉀不具揮發性，不利于質譜測定。如果采用當前常的方法對該雜質峰色譜餾份進行濃 縮論（通常采用氮氣吹干的方法），盡管目標物即雜質濃縮了，但是其中的磷酸鹽也同樣地 會成比例地濃縮，并且可能會引起pH的改變，影響待測成分的穩定性，因此這種濃縮方法 不是降低MS待測物中不揮發性緩沖鹽濃度的適宜方法。因此這種濃縮方法無法實現降低 MS待測物中不揮發性緩沖鹽濃度的目的。
[0014] 因此，化學分析領域技術人員迫切期待有一種能夠有效地降低液相色譜-質譜法 測試物中不揮發性緩沖鹽含量甚至除去的方法。
【發明內容】
[0015] 本申請的目的在于提供一種能夠有效地降低液相色譜-質譜法測試物中不揮發 性緩沖鹽含量甚至除去的方法。已經出人意料地發現，使液相色譜洗脫餾份照本申請方法 進行處理后，可以顯著地降低該液相色譜洗脫餾份中不揮發性緩沖鹽的含量。本申請基于 該發現而得以完成。
[0016] 為此，本發明第一方法提供了一種用于液相色譜-質譜分析測試中降低液相色譜 洗脫餾份中不揮發性緩沖鹽含量的方法，該方法包括如下步驟：
[0017] (1)使檢測物配制成溶液，將該溶液注入液相色譜儀以進行洗脫，從液相色譜洗脫 液收集待用于質譜檢測的目標物洗脫餾份；
[0018] (2)使所述洗脫餾份與助劑充分混合（任選的可額外加入有機溶劑（例如甲醇和 /或乙腈）混合）；
[0019] (3)使所得混合液通過離心或者過濾的方式使懸浮物和清液分離，分取清液；和， 任選的
[0020] (4)將所得清液進行濃縮，即得。
[0021] 根據本發明第一方面任一實施方案的方法，其中所述液相色譜是反相高效液相色 譜。
[0022] 根據本發明第一方面任一實施方案的方法，其中所述液相色譜洗脫所用的流動相 是水相和有機相的混合液。在一個實施方案中，所述有機相例如但不限于：甲醇、乙腈、乙 醇、四氫呋喃、異丙醇及其組合；特別是甲醇和乙腈。在一個實施方案中，所述水相中包含不 揮發性緩沖鹽。
[0023] 根據本發明根據本發明第一方面任一實施方案的方法，其中所述水相和有機相的 體積比可以是5 :95~95 :5的范圍。
[0024] 根據本發明第一方面任一實施方案的方法，其中所述不揮發性緩沖鹽例如但不限 于磷酸鹽、枸櫞酸鹽、醋酸鹽、高氯酸鹽中的一種或多種。
[0025] 根據本發明