一種堿性磷酸酶的酶促化學發光底物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫技術檢測領域，特別涉及可用于化學發光免疫檢測的一種高效酶 促化學發光底物。
【背景技術】
[0002] 化學發光是指在一個反應體系中通過化學反應生成一種激發態的產物（(f)，在其 回到基態的過程中，釋放出的能量轉變成光子（能量hY)，從而產生發光現象。
[0003] 化學發光免疫分析是繼酶免技術、放免技術、熒光免疫技術之后發展起來的一種 超高靈敏度的微量檢測技術，具備靈敏度高、檢測范圍寬、操作簡便快速、標記物穩定性好、 無污染等優點，因此成為世界范圍內發展非常迅速的非放射性免疫分析技術，是目前免疫 定量分析最理想的方法。
[0004] 在化學發光免疫分析中，常用發光物質包括魯米諾、異魯米諾、吖啶酯、1，2-二氧 雜環丁燒化合物（l，2-dioxetanecompound)。其中異魯米諾和吖啶醋作為示蹤分子直接 標記，屬于閃光型化學發光反應。魯米諾和1，2-二氧雜環丁烷化合物依靠酶作為示蹤分 子標記，屬于酶促輝光型化學發光反應。1，2-二氧雜環丁烷化合物是最新的超靈敏的堿 性磷酸酶（Alkalinephosphatase,AP)底物，在適宜的緩沖液中，隨著堿性磷酸酶（AP)的 催化水解作用，1，2-二氧雜環丁烷化合物分解發出的信號可持續20小時以上，是理想的化 學發光物質。國外生產廠家研制出以堿性磷酸酶（AP)為標記物，1，2-二氧雜環丁烷化合 物-3-(2-螺旋金剛烷）-4-甲氧基-4-(3-磷酰氧基）苯-1，2-二氧雜環丁烷（AMPPD)為 底物的試劑盒，與之相匹配的有DPC、AccessSubstrate、BioMerieux、Olympus全自動化學 發光系統。
[0005] 然而AP催化AMPH)的化學反應是水解反應，雖然具有較長的平臺期，但是其發光 強度較低，并且起光較慢，因此，該化學反應仍有待優化。
【發明內容】
[0006] 為了克服現有技術的不足，本發明的目的是提供一種發光信號強、進入平臺期較 快、持續時間長、常溫保存期長的堿性磷酸酶的酶促化學發光底物。
[0007] 為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案：
[0008] -種堿性磷酸酶的酶促化學發光底物，其特征在于，所述化學發光底物以水為溶 劑，含有以下組分：
[0009] 2-氨基-2-甲基-1-丙醇；
[0010]AMPPD；
[0011] 以及脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鈉與熒光化合物偶聯的發光增強劑（記作H0BEP系列 化合物）。
[0012] 脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鈉與熒光化合物的偶聯可起到共表面活性劑的作用，能使 該復合物更好的結合到化學發光緩沖體系中。
[0013] 當H0BEP系列化合物溶于水后，在濃度較低時呈單分子分散狀態，或被吸附在溶 液的表面上，從而降低表面張力；而H0BEP系列化合物的濃度增加至溶液表面已經飽和而 不能再吸附時，其分子即開始轉入溶液內部，由于H0BEP系列化合物分子的疏水部分與水 的親和力較小，而疏水部分之間的吸引力較大，當達到一定濃度時，許多H0BEP系列化合物 的疏水部分便相互吸引，締合在一起，形成締合體，即膠束，可觸發從激發態裂解產物到熒 光表面活性劑之間的能量轉移，因此可大幅度提高化學發光效率。
[0014] 其中，所述發光增強劑的結構式為以下的式（I)、式（II)、式（III)、式（IV)及 式（V)的其中一種：
[0015] (l)HOBEP-l:與香豆素類熒光化合物偶聯
[0016]
[0017] (2)H0BEP_2 :與熒光素類熒光化合物偶聯
[0018]
[0019] (3)H0BEP_3 :與萘酰亞胺類熒光化合物偶聯
[0020]
[0021] (4)H0BEP_4 :與羅丹明類熒光化合物偶聯
[0022]
[0023] (5)H0BEP_5 :與苯并咪唑類熒光化合物偶聯
[0024]
[0025]其中，
[0026] &選自Ci_28烷基的其中一種；
[0027]R2選自以下取代基中的其中一種：鹵素、羥基、疏基、氛基、硝基、烷基、烷氧基、齒 代烷基、氨基、烷基氨基、酰胺基；
[0028] n取5-10的整數。
[0029] 在具體實施例中，所述酶促化學發光底物還含有MgS04、ZnCl2及防腐劑。
[0030] 作為優選的【具體實施方式】，本發明的酶促化學發光底物以水為溶劑，含有以下組 分：
[0031]
[0032]
[0033] 在具體實施例中，所述防腐劑為ProClin300。
[0034] 本發明的堿性磷酸酶的酶促化學發光底物（APSH)的空白發光強度不高于200,檢 測靈敏度達到l〇-19molAP。此外，將本發明的酶促化學發光底物分別于37°C放置10天， 4°C放置18個月進行穩定性研宄的結果表明，本發明提供的酶促化學發光底物（APSH)熱穩 定性及實時穩定性均極好，能達到化學發光儀器檢測的要求。總體而言，本發明提供的新型 化學發光底物（APSH)強度高，靈敏度高，持續時間長，可達30-60min，穩定性好，可完全滿 足臨床檢測的需要，其主要性能指標已達到國外產品水平，大大降低了化學發光底物的成 本。
【附圖說明】
[0035] 圖1為實施例二的酶促化學發光底物（ASPH)及貝克曼化學發光底物（Access Substrate)在不同濃度AP條件下信號強度差異比較示意圖。
[0036] 圖2為實施例三的酶促化學發光底物（ASPH)反應動力學研宄實驗結果示意圖。
【具體實施方式】
[0037] 實施例一、酶促化學發光底物（APSH)的制備
[0038] ⑴材料：2_氨基-2-甲基-1-丙醇、AMPPD、MgS04及ZnCl2均為市售，化學純； ProClin300為美國Supelco公司產品；發光增強劑H0BEP-1為通過脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸 鈉與香豆素類熒光化合物偶聯得到，發光增強劑H0BEP-2為通過脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鈉 與熒光素類熒光化合物偶聯得到，發光增強劑H0BEP-3為通過脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鈉與 萘酰亞胺類熒光化合物偶聯得到，發光增強劑H0BEP-4為通過脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鈉與 羅丹明類熒光化合物偶聯得到，發光增強劑H0BEP-5為通過脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鈉與苯 并咪唑類熒光化合物偶聯得到。
[0039] (2)以超純水為溶劑，按表1. 1，表1. 2,表1. 3分別制備最低高濃度、最佳濃度和最 低濃度的酶促化學發光底物APSH-1，按表2. 1，表2. 2,表2. 3分別制備最低高濃度、最佳濃 度和最低濃度的酶促化學發光底物APSH-2,按表3. 1，表3. 2,表3. 3分別制備最低高濃度、 最佳濃度和最低濃度的酶促化學發光底物APSH-3,按表4. 1，表4. 2,表4. 3分別制備最低高 濃度、最佳濃度和最低濃度的酶促底物化學發光底物APSH-4,按表5. 1，表5. 2,表5. 3分別 制備最低高濃度、最佳濃度和最低濃度的酶促化學發光底物APSH-5 :
[0040]表 1. 1APSH-1 的配方一
[0041]
[0042]表 1. 2APSH-1 的配方二
[0043]
[0044] 表1. 3APSH-1的配方三
[0045]
[0046]
[0047] 表2. 1APSH-2的配方一
[0048]
[0049] 表2. 2APSH-2的配方二
[0050]
[0051] 表2. 3APSH-2的配方三
[0052]
[0053] 表3. 1APSH-3的配方一
[0054]
[0055]
[0056] 表3. 2APSH-3的配方二
[0057]
[0058] 表3. 3APSH-3的配方三
[0059]
[0060] 表4. 1APSH-4的配方一
[0061]
[0062] 表4. 2APSH-4的配方二
[0063]
[0064] 表4. 3APSH-4的配方三
[0065]
[0066] 表5. 1APSH-5的配方一
[0067]
[0068] 表5. 2APSH-5的配方二
[0069]
[0070]
[0071] 表5. 3APSH-5的配方三
[0072]
[0073] 實施例二、比較本實施例酶促化學發光底物（APSH)與貝克曼化學發光底物 (AccessSubstrate)測試各梯度濃度AP信號強度及線性關系