一種基于固相酶聯免疫熒光斑點的肝癌轉移診斷試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫學免疫學及腫瘤診斷技術領域，涉及一種基于固相酶聯免疫熒光斑 點的肝癌腫瘤細胞捕獲及診斷試劑盒。
【背景技術】
[0002] 原發性肝癌主要是肝細胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界上最常見 的惡性腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發病率的第5位，發病率仍持續升高。目前已成為我國 第二位癌癥死亡原因。盡管近幾十年以來在肝癌診治和基礎研宄方面均取得了長足的進 步，但總體而言，肝癌的預后并沒有得到顯著的改善，5年生存率僅為5%左右。手術切除仍 是最主要的治療方法，轉移復發己成為阻礙肝癌患者長期生存的關鍵。因此，臨床上迫切需 要探索肝癌轉移復發的相關預測指標來優化治療方案。對病人預后的準確評估可對高危轉 移復發病人增強輔助治療或采用侵襲性較小的治療方案，對低危轉移復發病人避免過度治 療，從而使實現治療個體化，提高病人的生活質量。
[0003] 傳統意義上的預后預測指標為腫瘤的臨床病理分期和腫瘤細胞分化分級，該分期 和分級能大致反映不同病人術后生存率的差別。但這些臨床病理特征并不能準確預測轉移 復發和病人預后。惡性腫瘤都會通過血液傳播轉移到身體的其他器官，而腫瘤轉移是導致 腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤細胞侵入到原發腫瘤細胞的周圍組織中，進入血液和淋巴 管系統，形成循環腫瘤細胞（CTC，circulatingtumorcell)，并轉運到遠端組織，再滲出， 適應新的微環境，最終"播種"、"增殖"、"定植"、形成轉移灶。因此早期發現血液中的肝癌 CTC，可提供更多信息，有望準確預測肝癌的轉移復發，對于患者預后判斷、療效評價和個體 化治療都有著重要的指導作用。
[0004] 外周血樣本由于其獲取技術簡單、創傷小、便于在同一患者多次重復進行，易于被 患者接受，對于預測轉移復發的可能性更為重要。尤其是針對易于血道轉移的腫瘤，利用外 周血標本檢測其中是否存在具有轉移傾向的腫瘤細胞，臨床意義更大。目前，已經開發的外 周血中癌細胞特異性標記物，如AFP，MAGE、CK19基因，以及外周血游離DNA檢測等已被初步 用于轉移復發的預測。然而，上述標志物既可能來源于原發灶腫瘤細胞，也可能來源于循環 中的腫瘤細胞，因此，該標志物表達水平的高低并不能準確反映直接影響腫瘤轉移的循環 腫瘤細胞的情況。因此，尋找能夠直接捕獲到外周血循環腫瘤細胞的方法己成為近年來研 宄的熱點。
[0005]目前現存的幾種循環腫瘤細胞捕獲技術主要包括：（1)基于流式熒光技術、免疫 磁珠分離技術針對CTC細胞膜上特異性蛋白開發的CellSearch試劑盒；（2)利用腫瘤細 胞體積較其他血細胞大的特性開發的ISET法（Isolationbysizeofepithelialtumor cells) ; (3)其他，如逆轉錄聚合酶聯反應、免疫細胞化學法等。但是這些CTCs檢測技術 均存在其局限性與不足，從而局限了其應用。（l)CellSearch試劑盒的缺點是：操作復 雜，費用高，計數效果低，能否從血液中檢測到腫瘤細胞很大程度上依賴于可分析的細胞數 量。（2)ISET法的缺點是：不適用于體積較小的細胞，體積小的CTCs有漏檢可能，造成假陰 性。同時也不適用于具有異質性的腫瘤細胞檢測。（3)逆轉錄聚合酶聯反應技術的缺點是：假陽性率較高，由于基因的非法轉錄和活性假基因，正常粒細胞可表達部分細胞角蛋白如 CKZO、CK19;細胞形態學被破壞，無法進一步判斷和進行腫瘤細胞基因和轉錄組變化；需要 更嚴格的標本保存條件和實驗條件。（4)免疫細胞化學法的缺點是：易造成靶細胞的丟失， 檢測靈敏性差。更重要的是，上述方法都是基于腫瘤細胞的表型特征，而不是基于其功能特 征，因此不能保證檢測到的循環腫瘤細胞的功能狀態（無法辨別"活細胞"和"死細胞"）。 考慮到有功能的循環腫瘤細胞才是造成腫瘤遠處轉移的罪魁禍首，因此，開發一種新的用 于功能性的循環腫瘤細胞檢測技術迫在眉睫。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于為克服已有技術的不足，提供靈敏度高、特異性強的免疫學原 理作為檢測反應，組成ELISP0T肝癌診斷試劑盒，用于檢測外周血中具有AFP及EpCAM分泌 功能的循環肝癌細胞，提高肝癌檢測的靈敏度和特異性，輔助肝癌轉移的診斷和鑒別診斷。
[0007] 本發明具體通過以下技術方案實現：
[0008] -種基于固相酶聯免疫熒光斑點的肝癌診斷試劑盒，包括96孔濾膜板、捕獲抗 體、熒光標記的檢測抗體、二抗、熒光防淬滅劑、CD45+磁珠及分選器、牛血清白蛋白（BSA)。
[0009] 所述的捕獲抗體為兔抗人AFP和EpCAM捕獲抗體。
[0010] 所述的熒光標記的檢測抗體為FITC標記的AFP捕獲抗體檢測抗體和Biotin標記 的EpCAM捕獲抗體檢測抗體。
[0011] 所述的二抗為抗-FITC-490及SA-550抗體。
[0012] 本發明所述的肝癌診斷試劑盒具體操作步驟如下：
[0013] 1)捕獲抗體預包被
[0014] 96孔板中加入1 : 60稀釋的AFP及EpCAM抗體100y1/孔，加蓋37°C孵育l_2h 或4°C過夜，棄包被液，用無菌的磷酸鹽緩沖液洗板，每孔加200y1含牛血清白蛋白的PBS， 加蓋，37°C孵育l-2h，棄上清液，將板直接用于檢測；
[0015] 2)采集血液樣本，并分離得到含循環腫瘤細胞的細胞群；
[0016] 3)檢測
[0017] 包被的96孔板中，待檢測孔加100y1細胞懸液，陰性對照孔加100y1 1640培養 液，陽性對照孔加100y1含1x104/ml的肝癌細胞株IfepG2 ;
[0018] 4)將96孔板放入濕潤的培養箱在37°C、5%C02培養18-24h，棄上清液，用含 0? 1 %Tween的PBS洗板；
[0019] 5)每個孔中加入100y1用1 %BSA的PBS稀釋的熒光素標記AFP及EpCAM檢測 抗體，置37°C孵育1-2小時；
[0020] 6)孵育后用PBS洗板后甩干，加入100y1用PBS1 : 1000倍稀釋的二抗，置37°C 孵育2小時；
[0021] 7)每孔加入50y1熒光防淬滅劑，放置于室溫閉光顯色；
[0022] 8)棄去熒光淬滅劑，將96孔濾膜板自然晾干；
[0023] 9)使用熒光顯微鏡計數每個反應空孔中熒光斑點，判斷結果。
[0024] 本發明結果的判斷方法為如果能檢測到AFP和EpCAM雙陽性的細胞即判定為陽 性；如果檢測不到AFP和EpCAM雙陽性的細胞則判定為陰性。
[0025] 本發明的有益效果為：克服了已有技術的不足，提供了靈敏度高、特異性強的免疫 學原理作為檢測反應，組成ELISP0T肝癌診斷試劑盒，用于檢測外周血中表達AFP及EpCAM 的循環肝癌細胞，提高肝癌檢測的靈敏度和特異性，輔助肝癌的診斷和鑒別診斷。
【附圖說明】
[0026] 圖1是種入不同濃度HepG2細胞后熒光顯微鏡觀測圖像；
[0027] 圖2是熒光顯微鏡下肝癌伴肺轉移患者標本的細胞觀測圖像。
【具體實施方式】
[0028] 下面結合實施例對本發明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發明的較佳實施 例而已，并非對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示 的技術內容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發明方案內容，依據本發明 的技術實質對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發明的保護范圍內。
[0029] 實施例1
[0030] 大部分肝癌細胞株IfepG2都能夠分泌AFP和EpCAM，因此是作為陽性對照的最佳選 擇。我們將體外培養的肝癌細胞株H印G2稀釋不同濃度（每孔4X105, 2X105及1X10 5個 細胞），應用本發明固相酶聯免疫熒光斑點的肝癌診斷試劑盒首先對試劑盒進行方法學的 測試：
[0031]( -）捕獲抗體預包被：
[0032] (1) 96孔板中預鋪1 : 60稀釋的AFP及EpCAM抗體（捕獲抗體）100y1/孔，加蓋 37°C孵育l_2h或4°C過夜；
[0033] (2)棄包被液，用無菌的磷酸鹽緩沖液（PBS)洗板3次，3min/次；
[0034] (3)每孔加200yl含牛血清白蛋白的PBS，加蓋，37°C孵育l-2h;
[0035] (4)棄上清液，將板直接用于檢測；或放于密封袋中，置4°C保存，1周內使用； [0036](二）循環腫瘤細胞檢測：
[0037](1)在包被的96孔板中加入：
[0038] a.待檢測孔：100y1不同細胞密度IfepG2細胞懸液（每孔4X105,2X10llX105 個細胞）；
[0039]b.陰性對照孔：100y1 1640培養液；
[0040] (2)將96孔板放入濕潤的培養箱在37°C、5%C02培養24小時；
[0041] (3)將96孔板取出，棄培養上清液，用含0? 1 %Tween的PBS洗板4次，3min/次；
[0042] (4)每個孔中加入100y1用1 %BSA的PBS稀釋的熒光素標記AFP及EpCAM檢測 抗體，置37°C孵育1-2小時；
[0043] (5)孵育后用PBS洗3次，3min/次，洗板后甩干，加入100y1用PBS1 : 1000倍 稀釋的抗-FITC-490及SA-550抗體（二抗），置37°C孵育2小時；
[0044] (6)每孔加入50y1熒光防淬滅劑，放置于室溫閉光顯色；
[0045] (7)棄去熒光淬滅劑，將96孔濾膜板自然晾干。
[0046](四）結果觀察：
[0047] 使用熒光顯微鏡計數每個反應空孔中紅綠熒光斑點，每一個綠色熒光點代表一個 分泌AFP的細胞；每一個紅色熒光點代表一個分泌EpCAM的細胞。其中，熒光顯微鏡對于紅 綠熒光激發光波長分別為：綠色熒光FITC(激發光波長490nm/發射光波長510nm)，紅色熒 光Cy3 (激發光波長550nm/發射光波長570nm)。
[0048] 種入不同濃度11印62細胞（每孔4\105,2\10 5及1\105個細胞）后，使用熒光 顯微鏡下檢測AFP(綠色）及EpCAM陽性（紅色）細胞數目。結果如圖1所示，加入不同濃 度的HepG2細胞后，本試劑盒所檢測到的陽性細胞數也呈現出明顯的數量梯度。上述結果 說明，本試劑盒能夠較好地反映樣本中的肝癌細胞數量。
[0049] 實施例2
[0050] 進一步利用肝癌轉移的患者（陽性組）及健康成人（陰性組）的外周血標本，對 本試劑盒進行方法學的測試。入選的患者信息：王某，男，54歲，診斷為"原發性肝細胞肝癌 伴肺轉移"，于2014年4月22日在西安交通大學第一附屬醫院肝膽外科住院治療。陰性組 為在我院門診行健康體檢的志愿者，作為正常對照。
[0051] 應用本發明固相酶聯免疫熒光斑點的肝癌診斷試劑盒進行診斷：
[0052](一）含循環腫瘤細胞的細胞群初分離：
[0053] (1)取4_5ml血液加入含肝素鈉或擰檬酸鈉的采血管，按抗凝劑：血液樣本體積比 1 : 9使用3. 8 %枸櫞酸鈉溶液抗凝；
[0054] (2)將含抗凝血的采血管顛倒混勻5次以上避免血液分層，按1 : 1-1 : 3的比例 將抗凝血加入含淋巴細胞分層液的無菌離心管中，形成明顯界面，在室溫下2000-3000rpm 離心 20_30m