診斷和治療前列腺癌的方法
【專利說明】診斷和治療前列腺癌的方法
[0001] 關于聯邦政府資助的研究與開發的聲明
[000引本發明是根據國家癌癥研究所（NCI)授予的基金號NCIK08CA160657由政府資 助進行的。政府具有本發明的某些權利。
[0003] 由子搖香材料的參考并入
[0004] 全部并入本文作為參考的是同期提交的計算機可讀的核巧酸/氨基酸序列表，所 述序列表確認如下；一份生成于2013年12月11日，命名為"715739_ST25.TXT"的4, 225 字節ASCII(文本）文件。
【背景技術】
[0005] 前列腺癌是最為常見的惡性疾病，是第二大導致美國男性死亡的疾病（Li 等，Biochim.Bio地ys.Acta, 1704:87-102(2004))。國家癌癥研究所（NCI)估計，2013 年美 國診斷出超過230, 000例的新增前列腺癌病例，并且超過29, 000名男性將死于前列腺癌。 前列腺特異性抗原或PSA測試依然被廣泛應用于前列腺癌早期檢測。雖然PSA測試檢測出 無癥狀男性中所患有的大部分前列腺癌（(Mettlin等，Cancer, 83巧）：1679-1684 (1998a); Mettlin等，Cancer, 82(2) :249-251 (1998b) ;Hump虹巧等，J.化ol.，155:816-820(1996); 和Grossfeld等，Epidemiol.Rev.，23 (1) : 173-180 (2001))，但是PSA檢測的特異度 較差，當PSA截止值被設為2. 6ng/mL時，特異度將低至33 % (Thompson等，N.Engl. J.Med.，350:2239-2246 (2004))，雖然靈敏度可高達83 %。PSA檢測特異度差的直接原因是 其他前列腺疾病如良性前列腺增生炬PH)和前列腺炎中PSA分泌的增加。因此，PSA水平 升高指示需要進行額外篩查，所述篩查通常W穿刺活檢的形式進行。最終，穿刺活檢的結果 決定前列腺癌的診斷。每年有超過一百萬例前列腺的穿刺活檢，每例活檢成本約為1500美 元，并且還會引起患者的不適。然而其中只有不到二十萬名被診斷為前列腺癌。因此，大部 分穿刺活檢是不必要的。
[0006] 目前，臨床上有許多診斷標志物被用于區分良性前列腺組織與惡性前列腺組 織，所述標志物包括例如a-甲基酷基-輔酶A消旋酶（AMACR，p504s)狂hou等，Amer. J.SurgicalPathology, 27 (6) : 772 - 778 (2003))和TMPRSS2-ERG融合基因（化等，Cancer Cell, 17(5) :443 - 54(2010))。但是該些標志物缺乏進行持續可靠診斷所需的特異度。相 似地，預后（pro即ostic)標志物（如TMPRSS2-ERG融合基因、PTEN缺失W及SPINK1過表 達）也在評估各種前列腺癌時缺乏特異度，導致相當數量的前列腺癌除了計算癌癥格里森 評分外沒有更進一步的預后信息。目前還沒有已知的生物標記物可W指示已經侵襲進入前 列腺周圍軟組織的前列腺癌。
[0007] 因此，有必要采用非侵入式方法對前列腺癌進行診斷與預后，并改善前列腺癌的 治療方法。本發明提供了該種方法。
[0008] 發巧概巧
[0009] 本發明提供了一種抑制前列腺癌細胞增殖的方法，所述方法包括使前列腺癌細胞 與抑制可溶性腺巧酸環化酶（sAC)蛋白活性的物質接觸，從而使前列腺癌細胞的增殖受到 抑制。
[0010] 本發明還提供了一種診斷男性對象前列腺癌的方法，所述方法包括；(a)從男性 對象的前列腺獲取細胞樣品，化）分析所述樣品中sAC基因的表達或sAC蛋白的生成，W及 (C)將樣品中sAC基因表達水平或sAC蛋白生成水平與對照進行比較，其中與所述對照相 比，所述樣品中sAC基因或sAC蛋白的過量表達指示所述男性對象患有前列腺癌。
[0011] 本發明提供了一種為前列腺癌對象選擇治療方案的方法，所述方法包括；(a)從 前列腺癌對象獲取前列腺癌細胞樣品，化）檢測所述樣品中sAC基因的表達或sAC蛋白的 生成，（C)將所述樣品中sAC基因或蛋白表達的水平與對照進行比較，（d)根據（C)的比較 來預后所述對象的前列腺癌，（e)根據（d)中對所述對象的預后來選擇對象的治療方案，W 及（f)向所述對象提供所述治療方案。
[00。]附圖概巧
[001引圖1A顯示了使用如下未經處理細胞系的裂解液進行sAC表達的蛋白印跡分析的 數據；PNT2、PC3和LNCaP。圖1B顯示了在PC3與LNCaP細胞系中使用R40抗體（只識別 "睪丸型"sAC同種型）和R21抗體（識別sAC"睪丸型"和"軀體型"同種型）進行sAC同 種型特異性蛋白印跡分析獲得的數據。
[0014]圖2顯示了sAC抑制劑KH7對前列腺癌細胞增殖的效果實驗數據。KH7處理后24 小時對細胞cAMP含量和每皿的細胞數量（起始密度；150, 000個細胞/皿）進行統計分析。 值為平均值 ±SEM(N= 5-8)。* 相比 0ymol/LKH7,P<0. 05。
[00巧]圖3A顯示了使用sAC特異性或亂序（scrambled)的siRNA處理72小時后（左圖） 或使用sAC特異性或亂序（scrambled)shRNA處理72小時后（右圖），使用LNCaP細胞裂解 液進行蛋白印跡分析的數據。圖3B-D顯示了SiRNA或shRNA轉染對細胞增殖的影響（圖 3B)，細胞培養液中LDH活性（相對單位（r.U.))(圖3C)與半脫天冬酶-3切割（圖3D)的 實驗數據。值為平均值+S.E.(N= 5-6)，* ;相比對照或亂序P<0. 05。蛋白印跡數據代表 了具有相似結果的五個獨立實驗。
[0016] 圖4A-4F顯示的實驗數據說明了抑制或敲減sAC誘導細胞周期停滯在G2期。圖 4A-4C顯示了使用流式細胞儀對對照LNCaP細胞、使用sAC抑制劑KH7 (20mol/L)或非活性 類似物KH7. 15 (20mol/L)處理24小時的細胞或者轉染sAC-特異性SiRNA或亂序SiRNA的 細胞進行細胞周期統計分析。圖4D包括的圖和圖像分別顯示了LNCaP細胞使用sAC抑制劑 KH7處理48小時后G2期細胞群和半脫天冬酶-3切割的時間進程。值為平均值+S.E.(n =8-10)，* ;相比對照或亂序SiRNAP<0. 05。圖4E和4F顯示了使用對照LNCaP細胞、或者 用KH7處理24小時的細胞或sAC敲減（SiRNA)的細胞的裂解液，對控制細胞周期進程通過 G2/M期和G1/S期檢測點的蛋白進行的蛋白印跡分析。處理條件與圖4A-4D中描述的條件 類似。所有的蛋白印跡數據代表=到五個具有相似結果的獨立實驗。
[0017] 圖5A-5E顯示的實驗數據表明sACWPKA非依賴性和EPAC依賴性的方式來控制 增殖和細胞周期。圖5A-5C的圖顯示了每皿細胞數量的統計分析（圖5A)、細胞培養基中 的U)H活性（相對單位（r.U.))(圖5B)W及G2期細胞群（圖5C)。處理（全部均為24 小時）如下；20mol/LKH7,20mol/LKH7. 15，100mol/L8-pCPT-cAMP巧-pCPT)，100mol/LN 6-苯甲酯基-cAMP化-Bnz)，3mol/LH-89,或lOOmol/L(化）-cAMP-S(化cAMP)。值為平均值 ±S.E.(n= 8-11)，* ;相比對照P<0. 05 ;相比KH7P<0. 05。圖抓和祀顯示了使用LNCaP 細胞裂解液對Rapl(Rapl-GT巧的活性形式和B-Raf的磯酸化形式進行蛋白印跡分析。處 理條件與圖5A-5C描述的條件類似。處理進行18小時。所有的蛋白印跡數據代表四到六 個具有類似結果的獨立實驗。
【具體實施方式】
[0018] 本發明提供了基于可溶性腺巧酸環化酶（sAC)蛋白的表達來抑制前列腺癌 細胞增殖、診斷前列腺癌、W及為前列腺癌患者選擇治療方案的方法。sAC是參與環 AMP(cAMP)生成的可溶性信號酶（見，例如國際專利申請公開版W02001/085753和美國專 利6, 544, 768)。sAC的表達已在角質形成細胞、黑素細胞、單核細胞、小汗腺管和人類皮膚 神經狂i卵in等，J.Invest.Dermatol.，130:1279-1287 (2010年））、W及身體的其他區域中 發現。cAMP介導細胞對營養條件和細胞外信號的應答，并且早已知道cAMP對細胞生長和 增殖會產生刺激效果和抑制效果值umont等，TrendsBiochem.Sci.，14:67-71 (1989);和 Rozengu;rt等，Science, 161-166 (1986))。
[0019]cAMP依賴性信號傳導已經被顯示在控制細胞增殖和調亡的數個信號傳導途徑 中發揮作用；然而，還沒有很好地確定cAMP信號對增殖和調亡的特異性效果。例如，通過 刺激G蛋白響應的跨膜腺巧酸環化酶（tmAC)或使用cAMP類似物處理來增加細胞內cAMP 的含量已在不同細胞類型中顯示能誘導或抑制增殖（參見，例如化chbaum等，J.Biol. Chem. ,283:4464-4468(2008);Misra和Pizzo'J.Cell.Biochem. ,108:998-1011(2009); Hewer等，J.Mol.Cell.Cardiol. ,50:87-98 (2011);和Lucchi等，PLoS 化e，6:e20785(2011))。類似地，已經報道了cAMP信號傳導對調亡的多種影響（見，例如 Leone等，Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver化ysiol., 293:G673-681(2007);Rudolph 等，J.Biol.Chem.，279:14828-14834 (2004);Smith等，Blood, 105:308-316 (2005) ;W及 aiang和Insel,J.Biol.Chem.，279:20858-20865 (2004))。該些差異可能是由于細胞類型 或實驗模型的差異，或者由于tmAC依賴性信號缺乏特異性。
[0020] sAC依賴的cAMP在調控細胞增殖中的作用尚不清楚。除了在胞質中有定位，sAC 也存在于細胞核中，在那里其通過蛋白激酶A(PKA)依賴性磯酸化來控制核cAMP反應元 件結合蛋白（CREB)轉錄因子的活性（見，例如Zippin等，FASEBJ.，17:82-84(2003))。 最近的研究還表明當角質形成細胞和黑素細胞從良性細胞轉變為癌（如皮膚鱗狀細 胞癌和黑色素瘤）時，sAC從細胞質向細胞核遷移（見，例如，Zippin等，J.Invest. Dermatol.，130:1279-1287 (2010);和Magro等，Arch.Dermatol.，148:335-：M4 (2012))。
[0021] 在一個實施方式中，本發明提供了抑制前列腺癌細胞增殖的方法，所述方法包括 使前列腺癌細胞與抑制可溶性腺巧酸環化酶（sAC)蛋白活性的物質接觸。術語"前列腺癌" 與術語"前列腺腫瘤（carcinoma)"為同義詞，指前列腺組織中形成的癌癥。"前列腺癌細 胞"指從前列腺癌中獲得