一種檢測金黃色葡萄球菌新型腸毒素sem的雙抗夾心法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種檢測金黃色葡萄球菌新型腸毒素SEM的方法，屬于免疫學技術領 域，具體設及的是一種檢測金黃色葡萄球菌新型腸毒素SEM的雙抗夾屯、法。
【背景技術】
[0002] 金黃色葡萄球菌腸毒素（staphylococcalenterotoxins，簡稱SEs)，是一種由金 黃色葡萄球菌分泌的細胞外毒素，其會導致中毒休克、食物中毒及一系列過敏性及免疫學 疾病。目前已發現的腸毒素有23種血清型，其中沈A-S邸稱為傳統腸毒素，SEG-SEX為新 型腸毒素。沈M屬于新型腸毒素類型，其理論分子量為24. 842KD。據文獻報道，S細基因W 基因簇（egc)的形式存在。由于腸毒素基因簇受同一操縱子調控。據調查顯示，目前在多 藥耐藥性菌株中約77.8%含有基因簇（端T)。基于5細基因流行的廣泛性，新型腸毒素SEM 也潛在威脅人類的健康。因此，食品及原料中SEM的檢出，對于控制由金黃色葡萄球菌新型 腸毒素SEM引起的食源性疾病具有重要意義。
[0003] 目前檢測金黃色葡萄球菌腸毒素的方法主要有免疫學法、分子生物學法和生物傳 感器法。基于PCR技術的分子生物學方法從基因水平進行診斷，可W檢測大量樣品，具有高 靈敏度和特異性，可檢測各類金黃色葡萄球菌的腸毒素基因。但PCR法只能判斷葡萄球菌 攜帶腸毒素的基因型，胞外腸毒素蛋白的表達往往受時間、水分活度（AW0. 85~0. 99)、酸堿 度（pH4. 0~7. 0)和溫度（8°C~30°C)等因素的影響，用PCR方法很難準確測定食品或臨床 樣本中腸毒素蛋白的含量。
[0004] 生物傳感器技術因其具有自動化、檢樣量少、分析速度快、生物功能膜可多次使 用等優點受到國內學者的親睞。目前檢測金黃色葡萄球菌腸毒素用的較多的生物感應器 主要為免疫感應器。最新研發的電化學免疫傳感器檢測B型腸毒素，其最低檢出限可達 0. 017ng/mL。該技術目前也僅限于檢測傳統的腸毒素，并且由于該方法檢測成本高，檢測穩 定性較差，該方法的發展受到限制。
[0005] 免疫學檢測法依靠抗原抗體的結合，只發生在抗原決定簇與抗體結合位點之間。 由于兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，因此，免疫學檢測法具有高度的特異性。酶 聯免疫吸附（ELISA)法因其具有操作簡單、低成本、靈敏度高，特異性強、重復性強、穩定性 高等優點，成為國內外研究熱點。
[0006] 對于金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測，現有的利用雙抗體夾屯、法檢測傳統A型腸毒 素的技術較為成熟，其靈敏度高達〇.〇282ng/mL。但利用雙抗體夾屯、法檢測新型腸毒素的報 道不多，對于一系列新型腸毒素（SEG-沈X)如沈M等的雙抗夾屯、檢測方法的研究將具有相 當廣泛的應用價值。
【發明內容】
[0007] 本發明的主要目的在于提供一種即可定性分析、也可定量檢測，且靈敏度高、準確 度高的檢測金黃色葡萄球菌新型腸毒素沈M的雙抗夾屯、法。
[000引為達到上述目的，本發明的技術方案如下； 一種檢測金黃色葡萄球菌新型腸毒素SEM的雙抗夾屯、法，包括W下步驟： (1) 用包被抗體包被酶標板，洗板，用于洗去未與酶標板結合的包被抗體，該包被抗體 為沈M單克隆抗體； (2) 加入封閉液對酶標板上多余結合位點進行封閉，洗板，用于洗去酶標板上多余封閉 液； (3) 在酶標板上加入樣品，解育后洗板； (4) WSEM兔抗血清為一抗加入酶標板，反應后洗板，再W辣根過氧化物酶標記的羊抗 兔IgG為酶標二抗，反應后洗板； (5) 加入顯色液使酶標板顯色，然后加入硫酸終止反應，用酶標儀檢測004。。， (6) 將檢測得到的0045。值帶入標準曲線即可求得樣品中沈M的含量； 當樣品中SEM濃度> 0. 5ng/mU樣品中SEM被配對抗體捕獲與酶標二抗結合，并催化 底物在450nm產生吸收值時，被判定為陽性； 當樣品中SEM濃度< 0. 5ng/mU樣品中SEM不被配對抗體捕獲或者捕獲數量太小不足W引起足夠的信號時，被判定為陰性。
[0009]本發明記載的方法對不同濃度的標準沈M進行0〇45。值檢測后，得到的線性范圍良 好，可W直接做成標準曲線，通過對樣品的〇〇45。值檢測后，用該值在標準曲線上找出對應的 濃度，即可實現對樣品的定量檢測。
[0010] 兔抗血清中存在非特異性蛋白，因而其很難達到較高的特異性，若單獨選作包被 抗體，易造成假陽性，不利于SEM抗原蛋白檢測，導致檢測準確率較低。本發明將僅針對一 種抗原決定簇的SEM單克隆抗體作為包被抗體，將SEM兔抗血清作為一抗加入反應體系中， 不僅克服了直接使用兔抗血清所帶來特異性問題，還提高了方法的靈敏度和準確性。
[0011] 目前常采用的Dot-ELISA檢測法W硝酸纖維膜（NC)為固相載體，據文獻報道，硝 酸纖維膜對蛋白的固定易受到非特異性蛋白、氨鍵作用干擾物、疏水作用干擾物的影響，從 而使膜上蛋白物理吸附能力變弱，易造成假陰性。而本發明采用聚苯己締酶標板作為固相 載體，其物理吸附能力較強，性質穩定，因而能克服因蛋白吸附問題而造成的假陰性。
[0012] 進一步，本發明優化了抗體包被濃度、一抗稀釋度、酶標二抗稀釋度、包被液、封閉 時間、標準品解育時間、酶標抗體解育時間、3. 3'，5, 5'-四甲基聯苯胺（TMB)顯色時間等。 通過該條件的設置可使最低檢測限為0. 5ng/mL，R2達到0. 9985。
[0013]本發明中各步驟的具體工作條件和過程如下： 所述步驟（1)的具體過程如下：用1.8~2. 7yg/mL的SEM單克隆抗體包被酶標板并在 4°C過夜，該SEM單克隆抗體的加入量優選為100yL/孔； 所述步驟（2)的具體過程如下；^59(^20%脫脂奶粉為封閉液，在37°C下封閉比~化，該 封閉液的加入量優選為200yL/孔； 所述步驟（3)中解育的溫度為37°C，解育的時間為60~90min; 所述步驟（4)中一抗加入后在37°C下反應比；所述酶標二抗加入后在37°C下反應 30~45min。該一抗和酶標二抗的加入量均優選為100uL/孔； 所述步驟（5)中顯色液加入后在37°C避光顯色7~10min;所述硫酸濃度為2mol/L。 該顯色液和硫酸的加入量均優選為100yL/孔； 其中，所述步驟（1)中的包被抗體、步驟（2)中的封閉液、W及步驟（4)中的一抗和酶標 二抗均采用抑=7. 4的1XPBS進行稀釋，一抗的稀釋比例為1:2000~1:4000,酶標二抗的稀 釋比例為1:6000~1:8000 ; 所述步驟（1)~步驟（4)中洗板的操作過程如下；倒去酶標板孔內液體，在吸水紙上拍 干，用含0. 05%Tween-20的PBST加滿孔，靜置3min,反復洗漆3~5次。
[0014] 所述顯色液由10mL顯色液A、125yL顯色液B、15yL3%的&〇2配置而成；其 中顯色液A由3. 5g的化2冊〇4.12&0、1. 1g的巧樣酸混合后加水至200ml，并調節抑值 至5. 0后制得；顯色液B由6mg的3. 3'，5, 5' -四甲基聯苯胺（TMB)加入1血二甲基亞諷 (DMS0)混合制得。
[0015]本發明與現有技術相比，具有W下優點及有益效果： 1、 本發明不僅能有效對新型腸毒素SEM進行定性分析，還能有效對新型腸毒素M進行 定量檢測，且檢測準確度高； 2、 本發明中的試劑穩定、易保存，且操作簡單、低成本、靈敏度高，特異性強、重復性強、 穩定性高；且本發明能同時檢測大量樣品，適用于金黃色葡萄球菌腸毒素SEM蛋白的檢測 和流行病學調查，具有良好的應用前景。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發明方法檢測得到的SEM標準曲線。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合實施例及其附圖，對本發明作進一步地詳細說明，但本發明的實施方式 不限于此。 實施例
[0018] 一、準備階段 本階段用于配置好相應濃度的各試劑物品等，本發明中所用試劑物品包括；包被抗體、 封閉液、樣品、一抗、酶標二抗、顯色液、硫酸。其中，酶標板為96孔聚苯己締可拆酶標板；該 包被抗體為SEM單克隆抗體，SEM單克隆抗體濃度為1.8~2. 7yg/mU封閉液濃度為5%~20% 的脫脂奶粉溶液，該SEM單克隆抗體和封閉液均采用抑=7. 4的1XPBS配置而成。樣品包 括檢測樣品和濃度分別為 0. 5ng/mL、lng/mL、2. 5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、 20ng/血的沈M標準品稀釋液。一抗為沈M兔抗血清，酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的 羊抗兔IgG，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG為市售產品，購自武漢=鷹生物技術有限公 司。硫酸濃度為2mol/L。
[0019] 二、測定階段 首先，繪制出沈M的標準曲線。本階段采用一種檢測金黃色葡萄球菌新型腸毒素沈M的雙抗夾心法，用于檢測出不同樣品的〇〇45。值，具體操作方法如下： (1) 在酶標板上加入包