循環血miR-34a作為輻射生物標志物在輻射監控中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及福射監控技術領域，尤其設及循環血miR-34a作為福射生物標志物在 福射監控中的應用。
【背景技術】
[0002] 目前，福射的監控通常都使用物理劑量計，但在有些情況下，單純使用物理劑量計 進行監測難W全面準確地反映福射對每個個體的影響。如動物福照實驗研究中，為了減少 操作人員接觸福射環境的機會，同時提高照射效率，通常都會使用動物自動傳輸裝置。有時 傳輸的動物會偏離照射中屯、，發生非均勻照射甚至是脫祀照射的情況，如果采用動物自身 攜帶的生物分子來確認是否受到照射，不僅可W減少實驗動物的廢棄，而且可W增加實驗 研究結果的可靠性。此外，在意外照射發生時，由于事件的突發性和不確定性，很難準確評 估實際照射情況，此時，如果能采用方便、靈敏的福射生物標志物來判斷每個個體是否受到 照射及福射損傷的程度，對于福射風險的準確評估并及時采取適當的措施顯得尤其重要。
[0003] 作為重要的遺傳物質，DNA的損傷方式和損傷程度與福射的種類和劑量密切相關， 是比較理想的能反映個體受照射程度的生物標志物。因此，淋己細胞染色體崎變、細胞微核 等方法都可W用于福射監測。此外，劑量相關的循環系統中粒細胞和淋己細胞減少、福射敏 感蛋白如淀粉酶、C-反應蛋白、轉化生長因子等也可W作為福射生物標志物。但是該些檢 測方法都有各自的不足之處，在及時性、便捷性、穩定性和靈敏性上不夠理想，如淋己細胞 染色體崎變的觀察程序復雜、需要時間較長(一般為2化W上);粒細胞和淋己細胞容易受感 染、炎癥等因素的影響；福射敏感蛋白受轉錄后調控，個體差異大、重復性不好。
[0004] microRNA(miRNA)是一類廣泛存在于生物體中、長度約18~25nt的非編碼小分 子RNA。它們通過與祀基因的信使RNA(mRNA)序列互補結合來實現基因表達的調節，參與 生物體的生長、發育、細胞分化、細胞調亡等一系列重要的生命過程。循環血中含有豐富的 miRNA,由于分子量小且常常包裹在囊泡里，循環血miRNA很難被RNA酶降解，耐反復凍融及 酸堿環境變化，保證了其能準確反映原初表達水平的可能性。因此，無論在血液中還是在提 取及檢測的過程中，miRNA都能穩定存在，從而保證了檢測結果的準確性，該些是淋己細胞、 福射敏感蛋白及其它核酸類分子所不能比擬的優點。另外，miRNA在不同物種間具有高度 的保守性，W動物模型得出的研究結果也適宜于人體的借鑒和參考。
[0005] 作為重要的基因轉錄后水平調控因子，miRNA積極響應于外界環境的改變，在機體 受到外源福射時，其表達也會發生顯著改變。如化cob等人的研究（PL0S0肥，2013,8 (2): G57603)發現，小鼠循環血中的miR-150在受到X射線和丫射線全身照射后呈現出明顯的 降低趨勢，并隨劑量和時間的變化呈現出一定規律，該些結果為尋找可作為福射標志物的 循環血miRNA提供了實驗和理論支持。值得注意的是，他們選取的照射劑量偏大（l-8Gy)， 且僅限于常見的電磁福射，應用于福射監測在靈敏性和廣泛性上還有很大的局限。前期研 究表明，小鼠循環血中與福照相關的miRNA有一百多種，因而有望從該些福射敏感的miRNA 中獲得理想的新福射生物標志物，并應用于福射環境下每個個體受照射情況的監控。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是提供一種循環血miR-34a作為福射生物標志物在 福射監控中的應用。
[0007] 為解決上述問題，本發明所述的循環血miR-34a作為福射生物標志物在福射監控 中的應用，其特征在于：該循環血miR-34a是指按常規方法從動物或人的血清中提取獲得， 其用于非均勻照射或意外照射大于化的條件下判斷照射及福射對動物或人的損傷程度。 [000引本發明與現有技術相比具有W下優點： 1、本發明W對福射比較敏感的血液系統為切入點，充分利用miRNA的生物學特點，通 過microRNAPCRArray等方法在循環血中逐步篩查福射相關的miRNA，最終獲得了理想 的新福射生物標志物miR-34a。該福射生物標志物在受到不同類型福射的照射后，循環血 miR-34a表達水平明顯上升，并且隨著照射劑量的增加呈現上升的趨勢，與淋己細胞染色體 崎變、粒細胞和淋己細胞減少、福射敏感蛋白等福射生物標志物相比，在及時性、便捷性、穩 定性和靈敏性上都更為優越。
[0009] 采取的福射源為化xitronR650型X射線儀產生的X射線和蘭州重離子加速器冷 卻儲存環（HIRFkCSR)生物福照終端產生的碳離子束（1古6+)。
[0010] (1)福射相關miRNA的篩查；W能量為300MeV/u的碳離子束全身貫穿照射6~8周 的清潔級雄性昆明小鼠（蘭州大學醫學院提供)，照射劑量為0.5Gy和2.0Gy，每個處理組 6只小鼠，并W未照射小鼠作為對照。照射后24小時取血，提取血清并分離、純化總RNA，用 miRCURYLNA?UniversalRTmicroRNAPCRArray(Exqion)巧片檢測 360 種血清miRNA 的表達變化水平，結果表明；福射處理后表達上升和下降的miRNA總共有一百多種，其中 0. 5Gy處理組表達變化超過2倍的miRNA有20多種，2. 0Gy處理組表達變化超過2倍的 miRNA有30多種。
[0011] 口)候選miRNA確定及其巧片測試：通過分析上一步的廣泛篩查結果，選擇了 20種可能成為福射生物標志物的miRNA組成了一個集合，W該些miRNA為內容定制PCR (PolymeraseQiainReaction,聚合酶鏈式反應）巧片。分別用X射線和lOOMeV/u碳離子 束全身注入照射，X射線的劑量為0. 5、2. 0和4.OGy，碳離子的劑量為0. 25和0. 5Gy(注； 碳離子束注入生物樣品時，引起的生物效應比較高，因此選擇的照射劑量相對較低)。照射 后24小時取血，提取血清并分離、純化總RNA，進行反轉錄和miRNAPCRArray巧片檢測，結 果再次表明；多個miRNA的表達水平在照射前后都有顯著的上升或下降。
[0012] 樹可作為福射生物標志物的miRNA確定；通過W下S個條件對該20種miRNA進行 篩選；福照后變化倍數大于2且顯著性檢測中P值小于0. 05W保證miRNA變化水平具有顯 著性差異；PCR檢測中平均Ct值（PCR反應中反應管內的巧光信號達到設定值時所經歷的 循環數）小于32W保證miRNA在血清中豐度較高、容易檢測。經過篩選之后，從X射線照 射組和碳離子照射組確定出6種可作為福射生物標志物的miRNA,包括miR-34a、let-7a、 miR-223和已經有報道的miR-150。
[0013] (4)循環血miRNA穩定性檢測；對該6種可作為福射生物標志物的循環血miRNA的 穩定性作了進一步考察。具體方法如下；選取鼠齡為6周，10周，16周的小鼠，在未經任何 處理的條件下取血清，用巧光實時定量PCR(qRT-PCR)方法檢測該6種miRNA的本底表達 水平，結果表明；所檢測的6種miRNA在不同年齡組別中變化很小，在小鼠血清中穩定存在。
[0014] 腳循環血miR-34a對福射的響應；循環血miR-34a表達水平在X射線和碳離子束 照射條件下都表現出明顯的上升趨勢；并且在0.5Gy的X射線和0.25Gy的碳離子束注入 照射條件下，miR-34a表達上升明顯，約為沒有受到照射時的2倍；并且隨著照射劑量的增 加，循環血miR-34a表達上升也呈現增加的趨勢。表明循環血miR-34a對福射的響應非常 靈敏，完全符合作為福射生物標志物的條件，具體的檢測數據結果見表1所示。
[0015] 表1.不同類型的福射處理后，循環血miR-34a表達水平均有提高
做將miR-34a的表達變化和已經有文獻報道的miR-150的表達變化作了對比，如表2 所示。W2Gy劑量處理結果為例，miR-34a表達上升了 3