利用電化學發光法檢測治療性抗體類藥物的細胞結合活性的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測治療性抗體類藥物的細胞結合活性的方法，特別是涉及一種 利用電化學發光法檢測治療性抗體類藥物的細胞結合活性的方法。
【背景技術】
[0002] 現階段，國內生物制藥行業在檢測大分子抗體藥物與其受體的結合活性時，主要 是通過酶聯免疫吸附巧LISA)的方法。ELISA作為常規的結合活性方法，在檢測大分子抗 體藥物與其受體的結合活性時存在一些難W克服的問題：1)一些抗原表位（如受體）難W 獲得商業化的產品，或受體提取制備比較困難；2)在做細胞結合試驗（cell-basedbinding assay)時，細胞無法包被在板上，尤其是息浮細胞；3)實驗過程中需要反復的清洗，多步 驟，比較繁瑣耗時。目前，另一種細胞結合試驗是通過流式細胞儀來檢測，雖然用流式細胞 儀檢測不用多次清洗，但卻存在儀器本身的技術平臺問題：當一些受體在細胞表面表達很 高時，會超出儀器的檢測限，在做活性試驗時會檢測不到上平臺，從而無法定量；同時在每 次使用流式細胞儀前都需要校正，比較費時。
[0003] 電化學發光（E化）是一種在電極表面由電化學引發的特異性化學發光反應。包括 了兩個過程，電化學反應過程；在工作電極上（陽極）加一定的電壓能量作用下，二價的H氯 聯化巧釘[Ru(bpy)3]"釋放電子發生氧化反應而成為H價的H氯聯化巧釘[Ru(bpy)3]3+，同 時電極表面的H丙胺自由基（TPA)也釋放電子發生氧化反應而成為陽離子自由基TPA+，并 迅速自發脫去一個質子而形成H丙胺自由基（TPA)，該樣在反應體系中就存在具有強氧化 性的H價的H氯聯化巧釘[Ru(bpy)3]3+和具有強還原性的H丙胺自由基（TPA)。化學發光 過程；具有強氧化性的H價的H氯聯化巧釘[Ru(bpy)J3+和具有強還原性的H丙胺自由基 (TPA)發生氧化還原反應，結果使H價的H氯聯化巧釘[Ru(bpy)3]3+還原成激發態的二價 的H氯聯化巧釘[Ru(bpy)3r，其能量來源于H價的H氯聯化巧釘[Ru(bpy)3r與H丙胺 自由基（TPA)之間的電勢差，激發態郵(bpy)3]"W英光機制衰變并W釋放出一個波長為 620nm光子的方式釋放能量，而成為基態的[Ru(bpy)J".上述化學發光過程后，反應體系 中仍存在二價的H氯聯化巧釘[Ru化py) 3]2+和H丙胺自由基（TPA)，使得電極表面的電化 學反應和化學發光過程可W繼續進行，該樣整個反應過程可W循環進行。通過上訴的循環 過程，測定信號不斷的放大，從而使檢測靈敏度大大的提高。
[0004] 電化學發光免疫法是新一代的標記免疫測定技術，既兼有發光分析的高靈敏度和 抗原抗體反應的高度特異性，因此，具有廣泛的應用價值。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是提供一種利用電化學發光法（E化）檢測治療性抗體類 藥物的細胞結合活性的方法。該方法是針對現有化ISA和流式細胞儀測定細胞結合試驗的 缺點進行開發的，而且本發明的方法能解決流式細胞儀檢測細胞表面高表達受體所存在的 儀器缺陷，同時實現了用細胞鋪板能更直接的反應其生物學活性，為cell-basedbinding assay提供一種更靈敏、簡潔有效的方法。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明的利用電化學發光法檢測治療性抗體類藥物的細胞 結合活性的方法，包括步驟：
[0007] 1)將細胞鋪于96孔板中，賠育1~化；
[000引 2)加入封閉液，賠育30min~Ih進行封閉；
[000引其中，封閉液是含體積濃度為10%~30%FBS(胎牛血清）的緩沖液；
[0010] 3)緩沖液清洗后，加入治療性抗體類藥物，賠育1~化；
[0011] 4)緩沖液清洗后，加入釘標記的抗人IgG(GoatAntiHumanAntibody,SULF0-TAG L油eled),賠育1~1.化；
[0012] 5)緩沖液清洗后，加入無表面活性劑的MSDread緩沖液；
[0013] 6)用MSDSectorImager6000讀96孔板，得到細胞結合活性結果。
[0014] 所述步驟1)中，細胞包括；表達相關表位的細胞，如包括；Raji、WIL2-S或DS-1等 細胞【該些B細胞可表達MHCII分子，MHC(majorhistocompatibilitycomplex);主要組 織相容性復合體】等；96孔板包括；MSD(MesoScaleDiscoveiy,Gaithersburg,MD)公司 的Single-SP0T96孔板；96孔板中的細胞密度為2XlO3個/孔~2XlO6個/孔，96孔板中 的細胞息液為25yL/孔~50yL/孔。
[001引所述步驟2)中，封閉液優選含體積濃度為10%~30%FBS的1XPBS緩沖液（即磯 酸鹽緩沖液）；封閉液的用量為40yL/孔~60yL/孔。
[0016] 所述步驟3)、4)和5)中，緩沖液清洗中的緩沖液包括；1XPBS緩沖液；緩沖液的 抑優選為7. 1~7. 3 (優選抑7. 2);清洗的次數優選為3次。
[0017] 所述步驟3)中，治療性抗體類藥物包括；單克隆抗體藥物；其中，單克隆抗體的大 小為140~160邸巧日大約150邸）;治療性抗體類藥物的加入量為40yL/孔~60yL/孔， 加入濃度范圍為20yg治療性抗體/mL~0. 05ng治療性抗體/mL。
[0018] 所述步驟4)中，釘標記的抗人IgG是MSD公司的釘標記的抗人IgG，其用量為 40y L/孔~60y L/孔。
[0019] 所述步驟5)中，無表面活性劑的MSDread緩沖液是MSD公司的產品，其用量為 150yL/ 孔~200yL/ 孔。
[0020] 所述步驟6)中，細胞結合活性的評價標準是W相對活性進行評價，其中，相對活性 的計算公式如下：
[0021]
[0022] 其中，測得的活力是指MSDSectorImager6000所測量得到的結果，預期的活力是 通過常規的紫外分光光度法檢測UV280nm所測得的抗體濃度，并且相對活性為70%~130% 則說明治療性抗體類藥物的生物學效力符合可接受標準。
[0023] 本發明中，活性炭將細胞緊緊吸附在96孔板上，通過電化學發光法，使釘標記的 抗人IgG與目標測定物巧日單抗藥物）特異性結合能檢測目標測定物巧日單抗藥物）與細胞 表面受體結合的結合活性。釘的化學性質不活潑，在空氣和潮濕環境中穩定；有形成配位化 合物的強烈傾向。將二價的H氯聯化巧釘[Ru(bpy)3]"與免疫體系中的一種物質結合，檢 測反應體系中的二價的H氯聯化巧釘[Ru(bpy)3]"經電化學發光過程后所發出的光，電化 學發光過程產生的光信號的強度與二價的H氯聯化巧釘[Ru(bpy)3]"成線性關系。
[0024] 本發明的有益效果如下：
[00巧]OH氯聯化巧釘為水溶性，且高度穩定的小分子物質，保證電