檢測細胞外生化參數的光電集成電位傳感器及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分析細胞生理代謝的傳感器技術領域，尤其涉及一種檢測細胞外生化參數的光電集成電位傳感器及其制備方法。
【背景技術】
[0002]活體細胞對外界刺激如藥物、環境因素變化和受體作用等產生響應，會引起細胞代謝等功能性變化，外在表現為生化參數的改變。在分解代謝過程中，活體細胞將吸收代謝物質(糖、氨基酸、脂肪酸等碳源)，產生能量(ATP)并且釋放出酸性產物。已有研宄證實酸化率(即H+濃度變化率)與細胞的生理狀態密切相關。細胞胞外氧化還原電位(即細胞外微環境的氧化還原狀態)，反應了自由電子的活性，與細胞的增殖、分化、凋亡及癌細胞侵蝕都有著密切的關系。
[0003]利用微型化電化學生物傳感器，可以將細胞培養在傳感器表面，細胞內的生理變化引起胞外環境的變化，胞外的電解質溶液與傳感器之間形成電化學池，從而將這些參數的變化通過二級換能器轉換為電信號輸出，最終實現定量化監測和細胞水平的分析。
[0004]由于各種細胞生化參數檢測的原理和技術的差異性較大，并且同時檢測存在相互干擾的問題，目前成熟的技術仍以單一參數檢測為主，例如基于光尋址電位傳感器的胞外酸化率檢測，具有特異性高靈敏度，已有非常成功的商業化產品，例如美國分子器件公司生產的微生理計。此外，主流的集成傳感器僅對各個檢測單元進行物理整合，各個單元的功能相互獨立，制備過程復雜，通常體積較大，不易實現細胞水平的檢測。再加之一些檢測技術在安全性和小型化方面的局限性，限制了其在細胞檢測方面的應用，例如胞外葡萄糖濃度的檢測，常用技術為采用電流型葡萄糖傳感器，需要在工作電極上施加一定的電壓，對細胞造成不可避免的損傷，而采用傳統的電位型傳感器雖然可以避免施加電壓，但其靈敏度和分辨率又無法達到細胞水平的測量要求；氧化還原電位檢測通常采用傳統大電極，其檢測靈敏度較低，且體積大難以封裝。
[0005]多參數聯合檢測有利于從多個角度反映細胞的生長代謝狀況和對外界刺激的反應，目前還沒有出現在同一個測試腔體中對細胞的能源消耗、代謝產物以及自由電子活性進行同時檢測的技術。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種檢測細胞外生化參數的光電集成電位傳感器及其制備方法。
[0007]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:一種檢測細胞外生化參數的光電集成電位傳感器，包括:傳感芯片、芯片PCB板、外置導線、外置電極和細胞培養測試腔體。
[0008]所述傳感芯片具有硅基底，硅基底背面具有三個光源照射窗口，三個光源照射窗口之間間隔至少1_，在硅基底正面與光源照射窗口相對應的位置分別設有第一敏感區域、第二敏感區域和第三敏感區域，在除第一敏感區域、第二敏感區域和第三敏感區域外的硅基底上表面通過離子注入或擴散形成重摻雜層，在硅基底正面覆蓋薄氧化層，作為H+離子敏感材料；在薄氧化層表面第二敏感區域對應的位置覆蓋第一金屬層，作為氧化還原電位敏感材料；在薄氧化層表面第三敏感區域對應的位置覆蓋復合膜，作為葡萄糖的敏感材料；所述復合膜由第二金屬層上電鍍聚吡咯和葡萄糖氧化酶的混合物形成；傳感芯片邊緣具有一焊盤，焊盤通過導線與第二金屬層相連；第一金屬層和復合膜的上表面、薄氧化層上第一敏感區域對應的位置以及焊盤均暴露于傳感芯片表面，其他區域均覆蓋Si3N4絕緣層；硅基底背面的非窗口區域覆蓋鋁電極；所述芯片PCB板上具有第一接口焊盤、第二接口焊盤、第一引線、第二引線、第一引腳和第二引腳，所述第一接口焊盤的形狀和尺寸與傳感芯片背面相同，并在光源照射窗口的相對應位置開有透光孔；第一接口焊盤通過第一引線與第一引腳相連，第二接口焊盤通過第二引線與第二引腳相連；第一引腳和第二引腳位于芯片PCB板的邊緣；所述外置導線一端連接在傳感芯片的焊盤上，另一端連接在第二接口焊盤上；所述細胞培養測試腔體的內側壁開有凹槽，所述外置電極固定在凹槽內。
[0009]一種檢測細胞外生化參數的光電集成電位傳感器的制備方法，包括以下步驟:
[0010](I)制備背面光源照射窗口:選擇電阻率為8?10 Ω.Cm的P型硅片作為硅基底，清洗烘干之后，在硅基底背面旋涂光刻膠，經紫外曝光顯影，采用濕法腐蝕，蝕刻出光源照射窗口，光源照射窗口頂部的硅基底剩余厚度為100 μ m ;
[0011](2)制備重摻雜層:在1000°C高溫擴散爐內，通干氧，硅基底正面熱氧化生長一層厚氧化層，厚度800?lOOOnm，隨后在厚氧化層上旋涂一層光刻膠，經紫外曝光顯影，采用濕法腐蝕去除正面暴露的氧化層，然后采用離子注入或擴散法形成P+重摻雜層，與此同時，P+重摻雜層表面也會有少量氧化層形成；
[0012](3)制備H+離子敏感膜材料:采用濕法腐蝕將硅基底正面的氧化層全部去除，然后在芯片正面熱氧化生長一層薄氧化層，厚度50nm ;
[0013](4)制備金屬敏感膜材料:在薄氧化層表面旋涂光刻膠，經紫外曝光顯影之后，磁控濺射20nm厚的鈦化鎢薄膜作為粘附層，接著磁控濺射沉積一層金屬層，厚度150?200nm，然后采用lift-off工藝將第二敏感區域、第三敏感區域、導線和焊盤以外的金屬層進行剝離；
[0014](5)制備片上隔離區域:采用LPCVD法在硅基底正面沉積一層Si3N4絕緣層，厚度I μm，隨后旋涂光刻膠，經紫外曝光顯影，蝕刻第一敏感區域、第二敏感區域、第三敏感區域、焊盤表面覆蓋的Si3N4絕緣層，而其他區域表面的Si 3N4絕緣層保留下來，作為片上隔離區域；
[0015](6)制備背面鋁電極:硅基底背面熱蒸發沉積金屬鋁，厚度300nm，并在鋁層表面旋涂光刻膠，經曝光顯影，蝕刻掉光源照射窗口表面的鋁層，保留非窗口區域的鋁電極；
[0016](7)傳感器的封裝:利用劃片工藝將硅基底分割成IcmX Icm的小片，取出一小片，將背面鋁電極涂上導電膠，并粘合在芯片PCB板上的第一接口焊盤處，放置于100 V的烘箱中固化I小時；將外置導線的一端焊接在第二接口焊盤上，將另一端涂上導電膠，粘合在傳感芯片表面的焊盤上，放置于100°C的烘箱中固化I小時，使得第二金屬層與第二引腳導通；然后將外置電極卡在凹槽內，再用環氧樹脂膠水將細胞培養測試腔體封接在芯片PCB板上，并使得傳感芯片暴露在細胞培養測試腔體內部；
[0017](8)制備復合膜:配制單體吡咯和葡萄糖氧化酶的混合溶液，吡咯單體濃度為0.1M，葡萄糖氧化酶濃度在20?300U/mL范圍內，將混合溶液滴加到細胞培養測試腔體內，將第二金屬層作為工作電極，第二引腳為工作電極的信號引出腳，Ag/AgCl作為參比電極，外置電極作為對電極，組成三電極體系，分別與恒電位/電流儀上的工作電極接口、參比電極接口、對電極接口相連，在工作電極上施加恒電流，電流密度為0.0lmA/cm2?1.0mA/cm2，電荷密度為10?40mC/cm2，單體吡咯發生聚合，并包埋葡萄糖氧化酶，在第二金屬層表面即可形成復合膜，厚度小于lOOnm，隨后采用pH7的磷酸鹽緩沖液對傳感芯片表面進行清洗，而后放置在4°C條件下干燥保存待用，得到光電集成電位傳感器。
[0018]本發明的有益效果是:
[0019](I)本發明在硅基底的光尋址電位傳感器表面沉積金屬層，可以對氧化還原電位參數進行高靈敏度檢測，體積小，易于封裝，有利于細胞外自由電子活度的檢測；
[0020](2)本發明結合MEMS工藝和電化學技術，在金屬層表面電聚合修飾聚吡咯/葡萄糖氧化酶復合膜，可以對葡萄糖濃度進行高靈敏度檢測，并且測試無需施加工作電壓，對細胞無刺激、無損傷，在不影響細胞正常生理活性的前提下實現能量消耗速率的檢測；
[0021](3)本發明以光尋址電位傳感器以基礎，在其表面制備多種敏感膜，可實現胞外酸化率、胞外葡萄糖消耗速率、胞外氧化還原電位三個生化參數的同時檢測，由于傳感器