己酰甘氨酸作為增重和肥胖傾向的生物標志物的制作方法
【專利說明】己酰甘氨酸作為增重和肥胖傾向的生物標志物
[0001]本發明一般地涉及營養和健康領域。特別地，本發明涉及新生物標志物、其用途和允許其診斷抵抗飲食誘導的增重，和/或易受飲食誘導的增重的可能性的方法。例如，生物標志物可以是己酰甘氨酸。此生物標志物也可用于診斷/監測生活方式改變對對象中增重風險的影響。
[0002]肥胖已經成為21世紀中最重要的全球性健康問題，因為其升高了患其他疾病，包括2型糖尿病、肝性脂肪變性(NAFLD)、癌癥、關節炎和心血管疾病(CVD)的風險。肥胖的病因學來自遺傳和環境因素諸如高熱量飲食、缺乏體力活動和行為的復雜相互作用。參與多種生理功能諸如腸道先天免疫系統的成熟和養分的消化/吸收的腸道微生物群也影響了若干種代謝疾病的發展并且似乎對肥胖具有顯著的影響。因此，發生肥胖的個體傾向根據這些多因素原因而不同。
[0003]攝入富含脂肪和/或碳水化合物的不平衡飲食已經與脂肪組織以及瘦組織諸如肝、肌肉和心臟中的增加的甘油三酯貯藏速率相關聯。此異位脂肪沉積誘導性脂毒性也與多種代謝病癥諸如高甘油三酯血癥、高血壓、高空腹血糖和胰島素抵抗(IR)相關聯。然而，一些超重或肥胖人可能發展出多種代謝病癥而其他人保持健康。例如，身體中脂肪沉積的定位影響代謝病癥的發展。已經將足以釋放致動脈粥樣硬化的脂連蛋白并處理脂肪酸的心外膜脂肪明確地與人中CVD標志物相關聯。相比較之下，已經將肝內脂肪與炎癥和胰島素抵抗相關聯。Wildman等人也突出了健康中年女性中的種族與族群差異與內臟和皮下脂肪組織的差別的代謝活性相關聯，這能影響發展出肥胖和CVD的族群相關的傾向。因此，在早期階段鑒定出發展肥胖相關的代謝病癥的可能性，以評價個體代謝狀態和有效地預防代謝疾病的發展是相關的。
[0004]因此為本領域提供允許早期-理想地在其增重之前-鑒定當消耗富含脂肪的飲食時很可能增重的對象的方法將是合乎期望的。
[0005]本說明書中對現有技術文件的任何參考不應被認為是承認此類現有技術是廣泛已知的或形成本領域中普通一般知識的一部分。
[0006]本發明的目的是提高本領域技術并且特別地是提供允許在早期有效地將人們分層為其是否很可能響應高脂肪飲食而增重的方法。
[0007]本發明人驚訝地發現本發明的目的能夠通過獨立權利要求的主題實現。從屬權利要求進一步發展了本發明的觀點。
[0008]因此，本發明提供了生物標志物，其用途和診斷抵抗高脂肪飲食誘導的增重的可能性的方法。
[0009]如本說明書中所用，詞語“包含”，“含有”，和相似的詞語不應以排他性或窮盡性含義解釋。換言之，其旨在意為“包括，但不限于”。
[0010]本發明人已經使用了代謝組學方法以實現本發明的目的。代謝組學在今天被認為是表征代謝表型的完善建立的系統方法，其包含多種因素諸如環境、藥物、飲食、生活方式、遺傳學，和微生物組因素的影響。與提示生理學變化的可能性的基因表達和蛋白質組數據不同，代謝物及其在細胞、組織和器官內的動態濃度改變，代表了生理調控過程的真正終點。
[0011]因此，研宄與多種飲食性干預和疾病發展關聯的逐漸的代謝改變是合適的方法。最近，基于代謝組學和脂類組學的發現已經加速了我們對疾病過程的理解，并且將提供用于與代謝綜合征相關聯的亞臨床病癥的預防和營養管理的新途徑。“組學”數據已經突出了能量代謝(Krebs循環)、脂類和氨基酸加工，以及炎性信號對肥胖和IR發作的貢獻。
[0012]使用隨時間收集的尿樣品的質子核磁共振(1H NMR)光譜學和增重監控的組合，本發明人已經在良好定義的C57BL/6J小鼠模型中鑒定了由高脂肪飲食誘導的逐漸增重的新的代謝生物標志物。公知此動物模型在同基因動物中顯示極端表型，即抵抗或傾向于高脂肪誘導的增重分布的動物。本發明人已經表征了用高脂肪飲食(HFD)飼喂的C57BL/6小鼠的短期(7天)和長期(60天)代謝適應并且已經建立了與HFD飼喂的小鼠(即抵抗或傾向于高脂肪誘導的增重的動物)中的表型變異性相關聯的具體代謝標志。通過使用代謝組學方法，發明人已經顯示線粒體代謝途徑(脂肪酸β氧化、支鏈氨基酸分解代謝、丁酸代謝、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸途徑和Krebs循環)由高脂肪飼喂快速上調，這可能反映線粒體的脂肪酸飽和以及能量代謝的損害。
[0013]發明人能夠顯示在HFD下肥胖抗性的小鼠與線粒體氧化途徑(β氧化、丁酸代謝和亮氨酸分解代謝)的具體激活相關聯，所述激活可能是針對脂肪酸過載的保護性機制。
[0014]這些結果強調了線粒體在肥胖發展中的作用并允許得出這樣的結論，S卩，使用發明人已經鑒定的具體的生物標志物組，能夠從早期代謝標志測定發展代謝病癥，諸如肥胖的可能性。
[0015]發明人能夠顯示在高脂肪飼喂一周后(第7天)的尿代謝響應使得不僅能預測每個個體的最終增重(第60天)，還能夠根據其抵抗或傾向于高脂肪誘導的增重的傾向而對動物分層。
[0016]因此，本發明涉及新的生物標志物己酰甘氨酸。
[0017]本發明還涉及己酰甘氨酸作為尿中用于檢測和/或定量抵抗高脂肪飲食誘導的增重的可能性的生物標志物的用途。相似地，本發明還涉及己酰甘氨酸作為尿中用于檢測和/或定量易受高脂肪飲食誘導的增重的可能性的生物標志物的用途。
[0018]本發明還涉及診斷受試者中抵抗高脂肪飲食誘導的增重的可能性的方法，所述方法包括測定先前從待測試的受試者獲得的尿樣品中己酰甘氨酸的水平，和比較受試者的己酰甘氨酸水平與預測定的參照值，其中預測定的參照值是基于對照群體中尿中的平均己酰甘氨酸水平，并且其中較之預測定的參照值樣品中增加的己酰甘氨酸水平表明抵抗高脂肪飲食誘導的增重的增加的可能性。相似地，本發明也涉及診斷受試者中易受高脂肪飲食誘導的增重的可能性的方法，所述方法包括測定先前從待測試的受試者獲得尿樣品中己酰甘氨酸的水平，并比較受試者的己酰甘氨酸水平與預測定的參照值，其中預測定的參照值是基于對照群體中尿中的平均己酰甘氨酸水平，并且其中較之預測定的參照值樣品中降低的己酰甘氨酸水平或沒有改變提示易受高脂肪飲食誘導的增重的增加的可能性。
[0019]本發明的此生物標志物也可用于診斷和/或監測生活方式的改變對受試者中增重風險的影響。對于此，可以在生活方式改變之前測定生物標志物水平并且在生活方式改變之后將獲得的水平可以與所述生物標志物的水平比較。
[0020]圖1:在飼喂HFD的η = 56只小鼠的群體中身體增重的變異性。(A)實驗設計。(B) 7天和60天HFD飼喂后小鼠的體重分布。(C)在每個時間點鑒定對肥胖非響應者(NR)和強響應者(SR)小鼠。在2個時間點或在實驗的整個過程中觀察若干NR和SR小鼠。(D)在飲食前(t0)、HFD飼養的7天后(tl)和60天后(t2)，對照(n = 24) ,NR(η = 30)，和SR (η = 29)小鼠的體重監控。s (η =平均土標準誤，非參數Mann和Whitney檢驗的ρ值*<0.05, **<0.001, ***〈0.0001.)
[0021]圖2:飲食轉換后7天和60天，C57BL/6HFD飼喂的或LFD飼喂的小鼠的1H NMR尿代謝譜。㈧來自LH)飼喂的小鼠或⑶ΗΠ)飼喂的小鼠的尿的平均1H NMR光譜。(C)7天時LFD和HFD飼喂的小鼠的尿代謝譜的OPLS-DA分數圖。(D) 60天時LFD和HFD飼喂的小鼠的尿代謝譜的OPLS-DA分數圖。(E)從OPLS-DA系數圖獲得的熱點圖顯示發現在HFD和LFD飼喂的小鼠中顯著不同的代謝物。通過顏色代碼展示代謝物的相關值。(紅色梯度:與HFD飼喂的小鼠正相關的代謝物和藍色梯度:負相關的代謝物)。
[0022]圖3:NR和SR小鼠的具體代謝標志。(A)來自NR小鼠或⑶SR小鼠的尿的1H NMR光譜平均值。(C) 7天時和(D) 60天時NR和SR小鼠的尿代謝譜的OPLS-DA分數圖。(E)從OPLS-DA系數圖獲得的熱點圖顯示發現在NR和SR小鼠中顯著不同的代謝物。通過顏色代碼展示代謝物的相關值。(紅色梯度:與SR小鼠正相關的代謝物和藍色梯度:負相關的代謝物)。
[0023]圖4:BCAA、丁酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸代謝、Krebs循環和β氧化中涉及的代謝物的尿排泄型的作圖。條狀圖顯示代謝物的帶有標準誤的平均比率在第7天至第O天或第60天至第O天的積分。Y軸提示LF、HF、NR和SR小鼠的平均值(任意單位)。LF和HF或NR和SR的平均比率之間的顯著差異使用非參數Mann Whitney檢驗計算:*〈0.05，**〈0.001, ***〈0.0001 (平均值，標準誤和ρ值在補充表3和4中)。用虛線箭頭突出間接代謝反應。
[0024]圖5顯示在預測NR和SR中代謝物重要性和穩健性，如通過隨機森林分析所評估的。
[0025]表1:在高脂肪誘導的增重中代謝物和增重之間的關系的總結
[0026]表2:在抵抗增重(NR)和傾向增重(SR)個體中選擇的代謝物隨時間的變化倍數的總結
[0027]本發明部分地涉及生物標志物，其中生物標志物是己酰甘氨酸。
[0028]在本文描述的實驗中，用HFD飼喂的小鼠展示出尿中己酰甘氨酸隨時間增加。不希望被任何理論束縛，發明人目前認為己酰甘氨酸在體內獲自肝中己酰-CoA與甘氨酸的結合并然后在尿中分泌。己酰-CoA是氧化的中間代謝物并且肉堿負責線粒體中脂肪酸的攝取，這是β氧化過程中的關鍵起始步驟。這些結果因此提示通過β氧化的脂肪酸分解的上調并且強調了線粒體中氧化性燃料的飽和，這可能改變能量內穩態。HFD小鼠的尿中若干Krebs循環中間物和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸途