氯霉素半抗原和抗原的制備方法及其在化學發光免疫試劑盒中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種半抗原、抗原及其制備方法，具體涉及一種氯霉素半抗原和抗原 的制備方法及其在化學發光免疫試劑盒中的應用。
【背景技術】
[0002] 氯霉素（化loramphenicol，CAP)是一種對革蘭氏陽性和陰性細菌都有很好的抑 制作用的廉價高效廣譜抗生素，一度被廣泛應用于農牧業中。但是動物源性食品隨著食物 鏈被人體長期攝入，可引發多種疾病。輕者破壞人體內正常菌群的平衡狀態，菌群失調，使 人體產生耐藥菌珠，給今后患病使用抗生素治療帶來不良影響；抗生素過敏體質的人會出 現過敏反應，危及健康。嚴重時可干擾骨髓細胞蛋白質的合成，并抑制幼稚細胞DNA合成， 導致粒細胞減少，引發再生障礙性貧血、溶血、紫痛等惡性疾病。
[0003] 鑒于氯霉素的毒副作用，國際食品學界將其列為禁藥，歐盟、美國等均在法規中規 定氯霉素殘留限量標準為"零容許量"狂erotolerance)，即不得檢出，根據歐盟"2002/657/ EC"標準規定，動物源性食物中氯霉素的最大要求檢出極限是0.3yg/kg。不久美國抑A也 做出相應的規定。我國農業部規定了CAP在所有食品動物的可食用組織中不得檢出，并將 其從《中國獸藥典》中刪除，列為禁藥。并相應制定了SN0219-93和SCT3018-2004行業標 準，與國際接軌。
[0004] 氯霉素的檢測方法分為物理化學法和免疫化學法，前者有液相色譜法（LC)、高效 液相色譜法（HPLC)、質譜法（M巧等，后者主要是酶免法巧LISA)，檢測的靈敏度均達到 ppb(yg/kg)級別。近幾年，國內外學者又研發出液相色譜串聯質譜法（LC-MS/M巧、液相色 譜電噴霧電離質譜法（LC-EITM巧、微生物分析等物理檢測新方法，對化ISA方法的應用也 有了進一步研究。
[0005] 化學發光免疫檢測方法具有特異性強、穩定快速、檢測范圍寬、操作簡單自動化程 度高、試劑穩定且有效期長（6^18個月）等優點，其檢測限比化ISA和理化檢測方法高幾個 數量級。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種氯霉素半抗原及其制備方法和在化學發光試劑盒中的 應用。
[0007]本發明提供的氯霉素半抗原，為式1所示的化合物；
[0008] 本發明還公開了式1所示化合物的制備方法，包括如下步驟： ① 取氯霉素644mg溶于10血1M鹽酸，加入鋒粉300mg，于80°C水浴中反應15min; ② 再次加入鋒粉300mg，繼續反應15min; ③ 將反應后的溶液過濾，調整濾液抑至8. 5,用10血己酸己醋萃取2次，合并有機相， 用無水硫酸軸干燥，真空干燥； ④ 將得到的固體產物溶于lOmL二甲基甲醜胺（DMF)，加氨氧化軸150mg，4-漠下酸 501mg，于80°C水浴中攬拌反應化； ⑥冷卻至室溫，加蒸觸水50血，調整抑至5. 0,用50血己酸己醋萃取2次，合并有機相， 無水硫酸軸干燥，真空干燥，即可得到氯霉素半抗原。
[0009] 本發明提供的氯霉素抗原，是將式1所示化合物和載體蛋白偶聯得到的偶聯物。
[0010] 常用載體蛋白均可采用，如牛血清白蛋白炬SA)，卵清蛋白（0VA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲狀腺蛋白（TG)或血藍蛋白（KLH)等。
[0011] 所述式1所示化合物與BSA偶聯得到的氯霉素抗原的結構示意圖見圖1。
[0012] 本發明還公開了所述氯霉素抗原的制備方法，包括如下步驟： ① 稱取氯霉素半抗原8. 5mg溶于2mLDMF，加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亞 胺（EDC) 4. 3mg，N-羥基下二醜亞胺（N服）5. 2mg，室溫攬拌反應化； ② 稱取載體蛋白50mg，溶于5mL0. 1M碳酸氨軸緩沖液； ③ 將氯霉素半抗原反應液逐滴加入到載體蛋白溶液中，室溫攬拌反應過夜； ④ 用PBS在4°C條件透析72h，期間換透析液6次； ⑥將透析液在無菌條件下用0. 22ym孔徑的濾膜過濾，分裝于安培瓶中，-2(TC保存。
[0013] 所述氯霉素抗原可W作為免疫原制備氯霉素特異性抗體，也可W作為包被原制備 化學發光微孔板。
[0014]應用氯霉素抗原制備得到的特異性抗體具體可為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0015] 所述氯霉素抗原、所述特異性抗體均可應用于檢測氯霉素。
[0016] 本發明還公開了應用氯霉素抗原和氯霉素特異性抗體制備得到的化學發光酶聯 免疫試劑盒。
[0017] 所述化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，包括：包被有氯霉素抗原的化學發光微孔板、 酶標抗體工作液、氯霉素標準溶液、發光底物液、濃縮復溶液、濃縮洗涂液。
[0018] 本發明依靠免疫學、免疫化學基本原理和殘留分析技術手段，設計、合成小分子目 標分析物半抗原，并與載體蛋白偶聯，制備有效人工抗原，免疫動物制備針對小分子分析物 的特異性抗體。利用抗原抗體的特異性免疫學反應，定量的檢測樣品中微量小分子目標分 析物。本發明制備方法簡便可行、成本較低，半抗原產率較高。本發明克服了現有檢測技術 中對氯霉素樣品預處理復雜、耗時、且需要大量有機溶劑萃取，W及在檢測過程中要用到精 密昂貴的檢測儀器而不適于推廣使用等缺點。本發明的氯霉素抗原，通過免疫動物可產生 了針對氯霉素的特異性抗體，用于快速檢測食品中的氯霉素殘留，具有操作簡單、快速，處 理樣品量大，靈敏度高，特異性強等諸多優點。
【附圖說明】
[0019] 圖1為氯霉素抗原的結構示意圖。
[0020] 圖2為氯霉素化學發光酶聯免疫檢測試劑盒標準曲線。
【具體實施方式】
[0021] W下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。
[0022] 實施例1、氯霉素半抗原的制備 氯霉素半抗原的制備方法，具體操作步驟包括： ① 取氯霉素644mg溶于10血1M鹽酸，加入鋒粉300mg，于8(TC水浴中反應15min; ② 再次加入鋒粉300mg，繼續反應15min; ③ 將反應后的溶液過濾，調整濾液pH至8. 5,用lOmL己酸己醋萃取2次，合并有機相， 用無水硫酸軸干燥，真空干燥； ④ 將得到的固體產物溶于lOmL二甲基甲醜胺（DMF)，加氨氧化軸150mg，4-漠下酸 501mg，于8(TC水浴中攬拌反應化； ⑥冷卻至室溫，加蒸觸水50血，調整抑至5. 0,用50血己酸己醋萃取2次，合并有機相， 無水硫酸軸干燥，真空干燥，即可得到氯霉素半抗原。
[0023] 半抗原的結構式見式1 :
[0024] 實施例2、氯霉素人工抗原的制備 一、氯霉素免疫抗原（CAP-BSA)的合成 ① 稱取氯霉素半抗原8. 5mg溶于2mLDMF，加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亞 胺（EDC) 4. 3mg，N-羥基下二醜亞胺（N服）5. 2mg，室溫攬拌反應化； ② 稱取BSA50mg，溶于5mL0. 1M碳酸氨軸緩沖液； ③ 將氯霉素半抗原反應液逐滴加入到BSA溶液中，室溫攬拌反應過夜； ④ 用PBS在4C條件透析72h，期間換透析液6次； ⑥將透析液在無菌條件下用0. 22ym孔徑的濾膜過濾，分裝于安培瓶中，-2(TC保存。 [00巧]免疫原的結構式見圖1。
[0026] 二、氯霉素包被抗原（CAP-OVA)的合成 ① 稱取氯霉素半抗原8. 5mg溶于2mLDMF，加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亞 胺（EDC) 4. 3mg，N-羥基下二醜亞胺（N服）5. 2mg，室溫攬拌反應化； ② 稱取0VA50mg，溶于5mL0. 1M碳酸氨軸緩沖液； ③ 將氯霉素半抗原反應液逐滴