一種用于藻細胞的單細胞凝膠電泳的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及單細胞檢測技術，特別提供了一種用于藻細胞的單細胞凝膠電泳的方 法。
【背景技術】
[000引單細胞凝膠電泳又稱曽星實驗，是由化tling等于1984年首次提出的一種通過檢^UDNA鏈損傷來判別遺傳毒性的技術。它能有效地檢測并定量分析細胞中DNA單、雙鏈缺口 損傷的程度。當各種內源性和外源性DNA損傷因子誘發細胞DNA鏈斷裂時，其超螺旋結構 受到破壞，在細胞裂解液作用下，細胞膜、核膜等膜結構受到破壞，細胞內的蛋白質、RNAW 及其他成分均擴散到細胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性條件 下，DNA片段可進入凝膠發生遷移，而在堿性電解質的作用下，DNA發生解螺旋，損傷的DNA 斷鏈及片段被釋放出來。由于該些DNA的分子量小且堿變性為單鏈，所W在電泳過程中帶 負電荷的DNA會離開核DNA向正極遷移形成"曽星"狀圖像，而未受損傷的DNA部分保持球 形。DNA受損越嚴重，產生的斷鏈和斷片越多，長度也越小，在相同的電泳條件下遷移的DNA 量就愈多，遷移的距離就愈長。通過測定DNA遷移部分的光密度或遷移長度就可W測定單 個細胞DNA損傷程度，從而確定受試物的作用劑量與DNA損傷效應的關系。該法檢測低濃 度遺傳毒物具有高靈敏性，研究的細胞不需處于有絲分裂期。同時，該種技術只需要少量細 胞。
[0003] 盡管單細胞凝膠電泳具有較高的靈敏度和優越性，W往利用該方法檢測浮游藻細 胞DNA損傷時也存在諸多問題。Erbes等人于1997年第一次將單細胞凝膠電泳運用于基因 毒性化合物引起的單細胞綠藻萊茵衣藻（化lamydomonasreinhar化ii)的DNA損傷巧rbes etal.，1997)。該方法通過對Sin曲等人（1988)的實驗流程進行改進，主要改動是利用含 有離子型去污劑的堿性裂解液和縮短堿解旋和電泳的時間。不幸的是，該方法在Erbes等 人報道之后再無人報道（Pan化OV6, 2001)。SvieSenS等人對該現象進行了推測，認為利用該 方法對萊茵衣藻的DNA損傷進行檢測存在如下一些技術難點；（1)細胞壁的存在導致細胞 裂解效率低下的問題；（2)在細胞核周圍存在物理或生物屏障，使得產生"曽星"拖尾現象 發生率低；（3)存在"曽星"圖像觀察和DNA損傷定量的困難（S、'it知etal.，2004)。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是克服單細胞凝膠電泳在浮游藻細胞DNA損傷檢測方面的障礙，提 供了一種用于藻細胞的單細胞凝膠電泳的方法，該方法特別適用于淡水綠藻細胞，方法簡 單，結果清晰，線性關系良好。
[0005] 為了達到上述目的，本發明采取W下技術措施：
[0006] 一種用于藻細胞的單細胞凝膠電泳的方法，包括W下步驟：
[0007] 1)微電泳槽的制作和表面改性；用玻璃刀沿光滑載玻片的寬將載玻片劃成20~ 25個25mmX3mmX1mm(長X寬X厚）的窄條。然后將該些窄條用中性玻璃膠（包含3%~ 5%娃酸鋼）貼到干凈的光滑載玻片上，圍成正方形小槽，即為微電泳槽。微電泳槽的表面 改性采用鍛膜法，即微電泳槽在2g/L的（常規分析用）正常烙點瓊脂糖浸沒Imin后，置 37°C解箱烘烤2~12h。
[000引2)原生質體的制備：將藻培養液離屯、，去上清液，藻細胞懸浮于酶解液中（使藻細 胞密度約為107個/mL)，25°C避光保溫1.化。lOOOXg離屯、Imin，然后用同體積0. 55mol/ L甘露醇洗漆一次，再次離屯、（l000Xg，lmin)后輕柔懸浮于0. 55mol/L甘露醇中。
[0009] 所述的酶解液為0.55mol/L甘露醇加入20g/L纖維素酶和lOg/L離析酶，pH5. 8。
[0010] 3)包埋細胞；將懸浮于甘露醇中的細胞與烙化的低烙點瓊脂糖（濃度是7. 5~ lOg/L)混勻，使100yL低烙點瓊脂糖凝膠中含有4000~5000個細胞，平鋪于微電泳槽中；
[0011] 4)細胞裂解；將包埋好藻細胞的微電泳槽放在表面皿中，加入藻細胞裂解液，液 面沒過微電泳槽，4°C避光裂解1~化。
[001引所述的細胞裂解液為2. 5mol/L化Cl，100mmol/L邸TA，10mmol/L Tris，pH 10， 1% (VA)Triton X-100，10% (V/V)DMS0。
[001引W酶解；利用特異性識別DM損傷并將受損的DM切割成DM斷片的核酸內切酶 按1:103~1:104倍數進行稀釋，37°C酶解30~45min。優選的，對于氧化脅迫造成的DNA 損傷，嚷嶺堿基氧化損傷可用甲酯胺喀晚[fapy]-DNA糖基化酶（FPG酶）檢測，喀晚堿基氧 化損傷可用核酸內切酶III(Nth酶）檢測，對UV造成的cis-syn型環了燒喀晚二聚體DNA 損傷可用T4核酸內切酶V(T4PDG酶）檢測。
[0014] 6)堿解旋：將包埋有藻細胞的微電泳槽置于堿性電泳液中4°C解旋20~40min。
[0015] 所述的堿性電泳液的配方為；300mmol/L化0H，lmmol/L化2邸TA，pH13。
[0016] 7)電泳，中和，干燥和染色，拍照與結果分析。
[0017] W上所述的步驟中，具體的，步驟7)中，電泳為冷水浴，在堿性解旋液中電泳 50min，電壓 30 ~35V，電流 200 ~300mA;中和步驟利用 0. 4mol/LTrisbuffer,pH7. 4， 室溫（20~25°C，W下相同）下中和立次，每次lOmin;37°C烘干。染色利用2yg/血艦化 丙晚PI染液，避光染色10~15min。W上所述的方法，優選的用于淡水綠藻細胞。
[0018] 本發明與現有技術相比，具有如下優點和效果：
[0019] (1)微電泳槽的制作采用普通的光滑載玻片，避免了磨砂載玻片背景巧光干擾的 缺點，使所得的巧光圖像具有背景巧光值低、樣品圖像清晰的特點。
[0020] (2)通過對微電泳槽表面改性，使所鋪制的凝膠只有一層，與傳統樣品制備要鋪制 S層凝膠W及隨后的改進型兩層凝膠工藝相比，具有樣品制備工藝簡單、成功率高、易于操 作和實驗成本低等優點。
[0021] (3)根據綠藻細胞具有細胞壁的特點，增加了去除綠藻細胞壁的步驟，并改進了細 胞裂解步驟的條件；同時根據不同類型的DNA損傷形式，加入相應的核酸內切酶進行酶解 的步驟，使得綠藻細胞內的損傷的核DNA更易在電場作用下發生遷移，使實驗成功率發生 顯著提高。（4)利用娃酸鋼為主要成分的中性玻璃膠，實現了玻璃窄條在光滑載玻片上的永 久固定。
【附圖說明】
[0022] 圖1為采用本發明方法對不同時間高壓隸燈福射作用下，蛋白核小球藻細胞的 T4PDG-單細胞凝膠電泳巧光圖像。
[0023]其中，高壓隸燈（hi曲voltagemercuiTlamp,HVML)福射強度為 49 + 0. 8nmol/ m2/s，照射 10s，30s，lmin，3min。陽性對照，太陽光（solarli曲t，SL)福射 816±20]imol/ mVs下照射30s。
[0024] 表1為采用本發明方法對不同時間高壓隸燈福射作用下，DM損傷的蛋白核小球 藻細胞的T4PDG-單細胞凝膠電泳參數分析。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0026] 實施例1 ;
[0027] 一種用于藻細胞的單細胞凝膠電泳的方法：
[002引 1)微電泳槽的制作和表面改性；用玻璃刀沿光滑載玻片的寬將載玻片劃成20~ 25個25mmX3mmX1mm(長X寬X厚）的窄條。然后將該些窄條用中性玻璃膠（包含3%~ 5%娃酸鋼）貼到干凈的光滑載玻片上，圍成正方形小槽，即為微電泳槽。微電泳槽的表面 改性采用鍛膜法，即微電泳槽在2g/L的（常規分析用）正常烙點瓊脂糖浸沒Imin后，置 37