細胞分析方法
【專利說明】細胞分析方法 【技術領域】
[0001] 本發明設及細胞分析方法。再具體而言，本發明設及對于用醒固定，在非水溶性的 包埋介質中包埋的組織標本中所含的構成腫瘤組織、非腫瘤病變組織、正常組織等的細胞 進行分析適宜的細胞分析方法。 【【背景技術】】
[0002] W往、在構成實體瘤的組織（腫瘤組織）、非腫瘤病變組織、正常組織等的組織的 細胞群的群解析中，使用從活著的組織分離為單個細胞而得到的樣品。但是，從活著的組織 得到的細胞是，所述細胞的狀態容易發生偏差，品質管理較難。另外，在上述解析中，將組織 中的細胞分離為單個細胞時需要長的時間。因此，僅在3維結構下保持的單個細胞的原本 的特征變化或消失。
[0003] 從而，有人建議將組織進行福爾馬林固定石蠟包埋（W下，稱為"FFPE")而先保存 3維結構下的細胞的原本的特征之后，再分離為單個細胞而分析的方法（例如，參照非專利 文獻1)。
[0004] 在非專利文獻1中公開了，在利用流式細胞儀的細胞的分析中，在從FF陽組織標 本得到單一細胞時，在含巧樣酸的溶液中，對于FFPE組織標本的薄切切片進行熱處理。
[0005] 【非專利文獻l】WillemECorver等，"高分解能多參數DNA流式細胞術使 得石蠟包埋組織中的腫瘤及間質細胞的細胞集團的檢測成為可能（化曲-resolution multi-parameterDNAflowcytometryenablesdetectionoftumourandstromalcell subpopulationsinparaffin-embeddedtissues)"、TheJournalofPathology、2005 年 4 月 11 日在線公開化ttp://interscience.wiley.com)、第 206 卷、pp. 233-241
[0006] 但是，本發明人發現，如在非專利文獻1中記載的一樣，除去組織標本的包埋介質 之后，在含巧樣酸的溶液中進行熱處理時，在用流式細胞儀分析的樣品中，殘留了不分離為 單個細胞的多個細胞塊，從而難W進行高精度細胞分析。
[0007] 本發明是鑒于上述W往技術的實情而進行的，旨在提供可使用流式細胞儀，高精 度分析組織中所含的細胞的細胞分析方法。
[000引【發明概述】
[0009] 本發明的范圍僅由隨附的權利要求定義，不受此發明概述部分的任何影響。
[0010] 從而，本發明提供使用流式細胞儀對從用醒固定、在非水溶性的包埋介質中包埋 的組織標本得到的細胞進行分析的細胞分析方法，其包括：
[0011] (a)通過對上述從用醒固定、在非水溶性的包埋介質中包埋的組織標本得到的樣 品實施上述包埋介質的除去處理，得到含組織、且上述包埋介質被除去的樣品的步驟、
[001引 化）通過對上述步驟（a)中得到的樣品在2元駿酸化合物的存在下進行熱處理，得 到含組織的經熱處理的樣品的步驟、
[0013] (C)使上述步驟化）中得到的樣品和具有細胞分散活性的酶接觸，將上述步驟化） 中得到的樣品中所含的多個細胞分離為單個細胞而分散到溶劑中的步驟、
[0014] (d)由上述流式細胞儀取得上述步驟（c)中得到的樣品中的細胞來源的光學信息 的步驟、及
[0015] (e)基于上述步驟（d)中取得的光學信息，分析細胞的步驟。
[0016] 由上述本發明可提供可使用流式細胞儀高精度分析組織中所含的細胞的細胞分 散方法。 【【附圖說明】】
[0017] 圖1是顯示研究使用實施例1~7及比較例1~5的被驗樣品之時的相對分散效 率的結果的坐標圖。
[001引圖2是顯示研究使用實施例8及比較例6的被驗樣品之時的細胞的分散效率的結 果的坐標圖。
[0019] 圖3(a)是使用0. 1質量％馬來酸水溶液（實施例9)之時的散點圖。
[0020] 圖3化）是使用0. 1質量％巧康酸水溶液（實施例10)之時的散點圖。
[0021] 圖3(c)是使用0. 1質量％巧康酸酢水溶液（實施例11)之時的散點圖。
[0022] 圖3(d)是使用0. 1質量％巧樣酸水溶液（比較例7)之時的散點圖。
[002引【發明詳述】
[0024] W下參照附圖描述本發明的優選的實施方式。
[0025] 本實施方式設及的細胞分析方法是使用流式細胞儀對從用醒固定、在非水溶性的 包埋介質中包埋的組織標本得到的細胞進行分析的細胞分析方法，其特征在于，包括；(a) 通過對上述從用醒固定、在非水溶性的包埋介質中包埋的組織標本得到的樣品實施上述包 埋介質的除去處理，得到含組織、且除去上述包埋介質的樣品的步驟、化）通過將上述步驟 (a)中得到的樣品在2元駿酸化合物的存在下進行熱處理，得到含組織的經熱處理的樣品 的步驟、（C)使上述步驟化）中得到的樣品與具有細胞分散活性的酶接觸，得到將上述步驟 化）中得到的樣品中所含的多個細胞分離為單個細胞而分散到溶劑中的樣品的步驟、（d) 由上述流式細胞儀取得上述步驟（C)中得到的樣品中的細胞來源的光學信息的步驟、及 (e)基于上述步驟（d)中取得的光學信息，分析細胞的步驟。
[0026] 本發明人發現，將從用醒固定、在非水溶性的包埋介質中包埋的組織標本得到的 細胞用流式細胞儀分析時，除去組織標本的包埋介質之后，在含巧樣酸的溶液中進行熱處 理時，在用流式細胞儀分析的樣品中，如后述的比較例所示，殘留不分離為單個細胞的多個 細胞塊。之后，本發明人又發現，不將除去了包埋介質的樣品在含巧樣酸的溶液中進熱處 理，而是在2元駿酸化合物的存在下進行熱處理，可W更高的分散效率使單個細胞分離一 分散到溶劑中。
[0027] 在本實施方式設及的細胞分析方法中，由于將除去非水溶性的包埋介質的樣品在 2元駿酸化合物的存在下進行熱處理，從而可W更高的分散效率使單個細胞分離一分散到 溶劑中。因此，可抑制使用流式細胞儀分析的樣品中所含的細胞塊造成的分析結果的誤差 的發生。從而，由本實施方式設及的細胞分析方法可使用流式細胞儀，高精度分析組織中所 含的細胞。
[002引在本實施方式設及的細胞分析方法中，首先，通過對從用醒固定、在非水溶性的包 埋介質中包埋的組織標本得到的樣品實施上述包埋介質的除去處理，得到含組織、且除去 上述包埋介質的樣品〔步驟（A))。通過進行步驟（A)，可保存僅在3維結構下保持的細胞的 原本的特征。
[0029] 在本實施方式中，"醒"只要可固定組織，就不特別限定。在本實施方式中，醒，例 如，可舉出福爾馬林（也被稱為甲醒）、戊二醒等。在本實施方式中，醒特別優選為福爾馬 林。
[0030] 在本實施方式中，"非水溶性的包埋介質"只要是為了使在天然的狀態的待測樣品 的切片制作及裝載成為可能而使用的公知的非水溶性的包埋介質即可，不特別限定。在本 實施方式中，非水溶性的包埋介質，例如，可舉出石蠟、火棉膠、碳蠟、該些的至少2種混合 物等，不特別限定。在本實施方式中，非水溶性的包埋介質優選為石蠟。
[0031] 在本實施方式中，作為組織，例如，可舉出實體瘤的組織（腫瘤組織）、非腫瘤病變 組織、正常組織等的組織。
[0032] 在本說明書中，"實體瘤"是指構成由腫瘤細胞和成纖維細胞、細胞外基質等組成 的塊的瘤。作為上述實體瘤的具體例，可舉出喉頭癌、食道癌、胃癌、結腸癌、大腸癌、直腸 癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膜腺癌、腎臟癌、肝臟癌、胸腺癌、脾臟癌、甲狀腺癌、SU甲狀 腺癌、腎上腺癌、前列腺癌、膀脫癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、骨癌、皮膚癌、肉瘤、骨 肉瘤、黑色素瘤、母細胞瘤、扁平細胞癌、非扁平細胞癌、腦腫瘤、口腔癌、癌腫、淋己瘤、纖維 瘤、腦膜瘤、膽管癌、褐色細胞瘤、膜島細胞癌、李-福勞口巧（Li-化aumeni)腫瘤、垂體部腫 瘤、多發性神經內分泌I型及II型腫瘤、頭頸癌、睪丸癌等，但不特別限定。在本說明書中， "非腫瘤病變組織"是指腫瘤W外的病變組織。作為非腫瘤病變組織，例如，可舉出良性前 列腺肥大、口腔白板癥、大腸息肉、食道前、癌性增殖、良性病變等，但不特別限定。作為上述 正常組織，是腫瘤組織及非腫瘤病變組織W外的組織，例如，可舉出從胃、肝臟、乳房、乳腺、 肺、膜腺、膜腺、子宮、皮膚食道、喉頭、咽頭、舌、甲狀腺等的器官得到的組織等，但不特別限