用于檢測小麥矮腥黑粉菌的膠體金試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及小麥矮腥黑粉菌防治領域，具體涉及一種用于檢測小麥矮腥黑粉菌的 膠體金試紙條。
【背景技術】
[0002] 小麥矮腥黑穗病是由小麥矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn，TCK)引起的 重要國際檢疫性病害，也是我國對外檢疫的一類危險性植物病害。該病害危害大、防治難， 一旦傳入會給小麥生產帶來毀滅性危害，通常發病率約等于小麥產量損失率。據Hoffmann 報告，在流行年份，因TCK引起的損失率一般為20 %~50 %，最高可達75 %~90 %。除了 產量損失外，被侵染的小麥出粉率也會隨著感染嚴重程度而降低，并且因含有TCK冬孢子 而極大地影響品質。小麥矮腥黑粉菌對我國的小麥生產存在潛在危機，該病在栽培條件下 的主要寄主為冬小麥，我國常年小麥種植面積約2300萬hm2,其中冬小麥占絕大部分，西 北、黃淮海等廣大冬麥區均適合小麥矮腥黑粉菌的定殖和發生危害，隨著我國加入WT0及 與TCK疫區國家-美國小麥貿易的增加，TCK傳入我國的可能性日益增大，因此，必須加強 對小麥矮腥黑穗病進行檢疫檢測，為病害防治提供技術儲備。
[0003] 目前對小麥矮腥黑粉菌的檢測主要采用PCR方法，該方法通過設計小麥矮腥黑粉 菌的特異引物，以待測樣品的DNA為模板，在嚴格的擴增條件下進行PCR反應，能夠準確判 斷待測樣品中是否含有小麥矮腥黑粉菌。然而，該方法步驟繁瑣，從取樣到獲得結果需要一 天時間，費時費力，并且需要在實驗室內進行。因此，需要開發一種快速、簡便、準確的檢測 小麥矮腥黑粉菌的方法，可以隨時檢測待測植株是否感染了小麥矮腥黑粉菌，從而對小麥 矮腥黑穗病進行早期預警。
【發明內容】
[0004] 本發明根據上述領域存在的不足和需求，提供一種用于檢測小麥矮腥黑粉菌的膠 體金試紙條及其檢測方法，該方法適用于各種環境，操作簡便易行，能夠快速準確地判斷待 測樣品是否感染小麥矮腥黑粉菌。
[0005] 本發明請求保護的技術方案如下：
[0006] 抗小麥矮腥黑粉菌的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC No. 10883的雜交瘤細胞所分 泌。
[0007] 分泌抗小麥矮腥黑粉菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其保藏號為CGMCC No.10883。
[0008] 用于檢測小麥矮腥黑粉菌的膠體金試紙條，包括樣品墊、金標墊、NC膜、吸水紙和 PS底板；所述樣品墊、金標墊、NC膜和吸水紙按樣品層析方向依次設置于PS底板上；
[0009] 其特征在于：所述金標墊上包被有膠體金標記的權利要求1所述的抗小麥矮腥黑 粉菌的單克隆抗體；
[0010] 所述NC膜上按樣品層析方向依次包括檢測線和質控線，所述檢測線上包被有滅 活的小麥矮腥黑粉菌孢子；所述質控線上包被有羊抗鼠二抗。
[0011] 所述金標墊上的抗體包被濃度為0. 096ug/cm。
[0012] 所述NC膜檢測線上的抗原蛋白的包被濃度為1. 5mg/ml。
[0013] 所述NC膜質控線上包被的抗體為羊抗鼠二抗，其包被濃度為0.5mg/ml。
[0014]用于檢測小麥矮腥黑粉菌的方法，其特征在于，采用權利要求3~6所述的膠體金 試紙條按照下列步驟進行檢測：
[0015] (1)將待測樣品滴加在樣本墊上；
[0016] (2)待質控線顯色后，觀察檢測線是否由無色變成紅色；若檢測線變成紅色，則待 測樣品中不含有小麥矮腥黑粉菌；若檢測線不變色，則待測樣品中含有小麥矮腥黑粉菌。
[0017] 本發明請求保護的抗小麥矮腥黑粉菌的單克隆抗體，其亞型為IgGl型，能夠特異 識別小麥矮腥黑粉菌的孢子。該抗體由保藏號為CGMCC No. 10883的雜交瘤細胞所分泌，其 效價高、親和力強、特異性好，與常見的小麥銹病無交叉反應，可用于檢測樣品是否含有小 麥矮腥黑粉菌。
[0018] 本發明還請求保護分泌抗小麥矮腥黑粉菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其保藏 號為 CGMCC No. 10883。
[0019] 本發明提供用于檢測小麥矮腥黑粉菌的膠體金試紙條，包括樣品墊、金標墊、NC 膜、吸水紙和PS底板，利用膠體金夾心法檢測樣品中是否存在小麥矮腥黑粉菌。其檢測原 理為：樣品滴加在樣品墊上后，便朝著吸水紙的方向泳動，金標墊上膠體金標記的抗小麥矮 腥黑粉菌的單克隆抗體（金標抗體）溶解，若樣品中沒有小麥矮腥黑粉菌，那么當金標抗體 到達NC膜上的檢測線時，金標抗體被檢測線上包被的滅活的小麥矮腥黑粉菌孢子捕獲，沉 積下來使檢測線變成紅色，多余的金標抗體繼續向前泳動，被質控線上的羊抗鼠二抗捕獲， 使質控線呈現紅色。若樣本中含有小麥矮腥黑粉菌，則金標抗體與小麥矮腥黑粉菌孢子結 合后向前泳動，越過檢測線，在質控線上被羊抗鼠二抗捕獲，使質控線呈現紅色，而檢測線 不變色。只有當質控線呈現紅色時，該檢測結果才有效。
[0020] 本發明還提供用于檢測小麥矮腥黑粉菌的方法，該方法操作簡單易行，只需將病 菌孢子用0. 02mol/l PBS緩沖液處理后，滴加在本發明試紙條的樣本墊上，室溫反應約 5-10min后，待質控線顯色后，觀察檢測線是否由無色變成紅色；若檢測線變紅，則表明待 測樣品中不含有小麥矮腥黑粉菌或者待測植株未感染小麥矮腥黑粉菌；若檢測線不變色， 則待測樣品中含有小麥矮腥黑粉菌或者待測植株感染了小麥矮腥黑粉菌。采用本發明試 紙條進行檢測，不需要儀器設備，在實驗室和野外均可進行，從取材到獲得檢測結果僅需15 分鐘，操作十分輕松，能夠對小麥矮腥黑穗病進行早期預警，以便及時采取防治措施，大大 減少病害造成的損失。
[0021] 生物保藏信息：
[0022] 生物材料名稱：TCK-2_2
[0023] 分類命名：對小麥矮腥黑粉菌的單克隆抗體雜交瘤細胞株
[0024] 保藏日期：2015年06月05日
[0025]保藏號：CGMCC No. 10883
[0026] 保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0027] 地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所
【具體實施方式】
[0028] 以下通過具體實施例對本發明進行解釋和說明，需要聲明的是，下述實施例僅作 為舉例說明，而不以任何方式限制本發明的范圍。
[0029] 生物材料
[0030] 小麥矮腥黑粉菌：已知菌種，中國農業科學院植物保護研宄所麥類病害研宄組。
[0031] 葉銹菌THT:已知菌種，中國農業科學院植物保護研宄所麥類病害研宄組。試劑與 溶液：
[0032]HAuCL4(進口，sigma)，BSA(進口，巴斯夫或sigma)，PEG (20000)，二氯二甲硅烷 + 氯仿，各種普通化學藥品，表面活性劑，緩沖溶液若干。
[0033] 標準品：黑粉菌孢子（濃度：1000ppm)
[0034] 主要材料儀器：
[0035] 劃膜儀（biodot XYZ3060);膠體金顆粒（北京勤邦生物技術有限公司）；電磁加熱 攪拌套式恒溫器；洄流圓形燒瓶；蛇型冷凝管；攪拌子；分光光度計；高速冷凍離心機；烘 箱；切條機（biodot CM4000);除濕機；封口機；NC膜（whatman FF120);膠體金墊（聚醋膜 whatman);樣品墊（玻璃纖維whatman，S2樣品墊（處理液成分是：以0? 02mol/l PBS為母 液分別添加0.5% tween 20, 2%蔗糖，2% BSA);吸水紙、PS(國產進口皆可）。
[0036] 實施例1、小麥矮腥黑粉菌單克隆抗體的獲得
[0037] -、雜交瘤細胞的制備
[0038] 實驗動物為BALB/c小鼠，由中國軍事醫學科學院提供。
[0039] 1、抗原制備
[0040] 用小麥矮腥黑粉菌孢子作為免疫原，按常規的小鼠免疫方法對小鼠進行免疫。
[0041] 2、制備雜交瘤細胞
[0042] (1)挑選小麥矮腥黑粉病血清檢測較好的小鼠，進行加強免疫，同時準備SP2/0骨 髓瘤細胞，放在37°C二氧化碳培養箱中進行培養，加強免疫3天后進行融合。
[0043] (2)取已經免疫小麥矮腥黑粉菌的的BALB/c小鼠，通過頸脫位致死小鼠，浸泡于 75%酒精中5分鐘。將小鼠取出晾干，放入超凈工作臺中，剪開外皮，暴露出腹腔的上皮，在 脾臟處將上皮剪開小口，取出脾臟，放入培養皿中，用注射器吸取不完全培養液，打到脾臟 里面，吹出脾細胞，如此反復，直至脾臟吹至透明為止。
[0044] (3)用吸管將SP2/0從瓶壁上吹下，再將SP2/0懸液全部移到上述脾細胞懸液中， 把離心管蓋子擰緊。室溫l〇〇〇r/min離心5min。離心好后倒掉上清，用吸水紙將流動液體 吸干，混勻細胞，加入融合劑，2分鐘后緩慢加入不完全培養液進行終止融合。室溫1000r/ min離心5min，棄掉上清，加入HAT培養液進行鋪板培養。
[0045] (4)用間接酶聯免疫吸附法檢測融合細胞的陽性率，一共有6個孔對黑粉菌有陽 性反應，然后經有限稀釋對檢測出的6個孔的陽性雜交瘤細胞分別進行克隆，篩選得到1個 對黑粉菌陽性顯色較高的細胞株，將其擴大培養并凍存。
[0046] 獲得了穩定分泌抗小麥矮腥黑粉菌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其細胞株編號 為：1E3,送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏號為：CGMCC No.10883。
[0047] 二、單克隆抗體制備
[0048] 1、采用體內誘生法大量制備單克隆抗體。
[0049] (1)制備腹水前注意觀察，雜交瘤細胞（CGMCC No. 10883)生長飽滿，狀態良好，占 總體積的70%即可進行抗體制備。準備好離心管，用無菌的滴定管小心吹打細胞瓶底部，使 細胞從瓶底脫落，此動作重復10次左右，將吹好的細胞無菌轉移至離心管內1000轉/min 離心5min，小心將離心的上清倒掉，向離心管中加入DMEM，將細胞混勻，吸入注射器中，注 入已經注射石蠟油的小鼠體內。
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