一種pd-1抗體檢測試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種抗體檢測試劑盒，特別是涉及一種ro-i抗體檢測試劑盒及其應 用。
【背景技術】
[0002] 在正常情況下，機體免疫反應激活產生的特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL)可以 殺死體內的腫瘤細胞。腫瘤的免疫抑制作用是腫瘤細胞逃避機體免疫系統殺傷的重要機 制。腫瘤免疫學領域的最新研宄發現，程序性死亡分子-l(PD-l)介導的免疫抑制反應是 CTL發生凋亡、無力以及功能耗竭的重要原因。腫瘤細胞及其腫瘤相關的免疫抑制性細胞 表面表達B7-H1/4分子，它們是已知的H)-l配體，當CTL進入腫瘤微環境時，CTL細胞表面 的H)-l會被其配體激活，引發胞內的SHP1/2的磷酸化，進而導致細胞凋亡或功能耗竭，從 而無法有效殺傷腫瘤細胞。
[0003] 目前，通路阻斷劑抗ro-1和B7-H1/4單克隆抗體的相關研宄具有突破性的進展， 研宄發現其能阻斷ro-i對t細胞的抑制作用，從而激活腫瘤患者體內的免疫細胞殺瘤效 應，減少抑制性調節T細胞效應，以增強CTL殺傷癌細胞的功能，其已成為近年來免疫治療 的熱點。多項荷瘤動物實驗結果表明，阻斷ro-i通路可以增強抗腫瘤效應、延長生存期、改 善預后。針對ro-i通路阻斷的單克隆抗體用于進展期惡性黑色素瘤的三期臨床試驗已經 完成，其抗腫瘤效果顯著，已被美國FDA批準為可上市藥物。由于ro-i抗體的廣譜抗癌作 用，其對腎癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、白血病、頭頸癌、腸癌和腦瘤等癌癥的臨床療效研宄也 正在二期或三期臨床試驗之中。
[0004] ro-1抗體作為一種新型、安全、高效的抗腫瘤藥物，勢必將在臨床腫瘤治療中被大 量應用，科研領域也會對該藥物的劑型、藥代動力學等做深入的研宄，因此迫切需要一種針 對ro-i抗體的特異性檢測方法。
[0005] 雙抗體夾心法酶聯免疫技術是目前對蛋白質類物質進行精確定量最為有效的方 法，其原理是將待測蛋白的一種抗體包被至固相載體（例如酶標板）上，用于特異性捕獲待 測蛋白，然后采用待測蛋白的另一種標記抗體（例如偶聯HRP的二抗等）進行標定和檢測。 然而，PD-1抗體本身就是一種IgG抗體，其具有與相同物種來源IgG相同的結構，大部分區 域（約2/3序列）為恒定區，同一物種的IgG恒定區的氨基酸序列和結構相同，不同物種的 IgG恒定區根據進化程度不同具有不同程度的同源性；可變區主要是結合特異性抗原結構 域，由于難以獲得針對可變區的抗IgG抗體，因此一般不會采用該區的表位制備二抗。如果 采用針對恒定區表位的兩種抗IgG抗體，顯然無法排除待測血清、組織液等樣本中本身含 有的igG的干擾，因此傳統的雙抗體夾心法無法實現對ro-i抗體的特異性檢測。目前，尚 無有效的精確測量ro-i抗體濃度的方法，尤其如何測定動物或人血清中ro-i抗體的濃度 成為亟待解決的問題。
【發明內容】
[0006] 本發明提供一種ro-i抗體檢測試劑盒及其應用，用于解決現有技術中的雙抗體 夾心法無法實現對ro-i抗體的特異性檢測等技術缺陷。
[0007]本發明提供一種ro-i抗體檢測試劑盒，包括固相載體、抗體捕獲劑和標記抗體， 所述抗體捕獲劑為ro-i細胞膜外結構域的重組蛋白，其氨基酸序列如SEQIDN0. 1。
[0008] 在本發明的ro-i抗體檢測試劑盒中，ro-i細胞膜外結構域的重組蛋白能夠 特異性捕獲待測樣本中的ro-i抗體，其可以通過普通市售獲得，例如可以采用ACR0 Biosystems公司生產的貨號為TO1-M5228的重組蛋白；標記抗體能夠特異性地與ro-l抗 體結合并且偶聯有產生檢測信號的物質（例如辣根過氧化物酶、鏈霉素等）。
[0009]該試劑盒的工作原理是：將待測樣本加入到預包被抗體捕獲劑的固相載體后，抗 體捕獲劑特異性捕獲待測樣本中的ro-1抗體，隨后加入的標記抗體特異性地與ro-i抗 體結合，通過對標記抗體上偶聯物質產生的檢測信號進行檢測，從而能夠得到待測樣本中 ro-i抗體的濃度。
[0010] 可以理解的是，在本發明的ro-i抗體檢測試劑盒中，固相載體和抗體捕獲劑可以 獨立進行包裝，也可以預先將抗體捕獲劑預包被在固相載體上形成預包被固相載體，從而 對預包被固相載體進行包裝。
[0011] 在本發明中，所述標記抗體可以為辣根過氧化物酶或鏈霉素標記的IgG抗體；特 別是，該標記抗體與ro-i細胞膜外結構域的重組蛋白的來源物種相同，在一實施方式中， ro-i細胞膜外結構域的重組蛋白來源于小鼠，標記抗體可為辣根過氧化物酶（hrp)偶聯的 山羊抗大鼠IgG抗體。所述固相載體可以采用本領域常規載體，例如酶標板。
[0012] 此外，本發明的ro-1抗體檢測試劑盒還可以包括參照品，參照品有利于保證檢測 的準確性，例如可以是ro-i抗體標準品、陽性對照品和陰性對照品中的一種或多種。其中， ro-1抗體標準品可以是美國Bioxcell公司生產的克隆號為RMP1-14的ro-1抗體，其是小 鼠惡性腫瘤模型治療實驗中用于ro-1阻斷最常用的治療抗體，抗腫瘤效果顯著；陽性對照 品可以是陽性血清、陽性組織勻漿液等；陰性對照品可以是陰性血清、陰性組織勻漿液等。
[0013] 進一步地，本發明的ro-1抗體檢測試劑盒還可以包括測定所需的常規試劑，例如 可以包括包被緩沖液、洗滌緩沖液、樣品稀釋液、封閉液、顯色液和終止液中的一種或多種。
[0014]在一實施方式中，包被緩沖液為pH9. 6的碳酸鹽緩沖液，每升溶液中含有Na2C03 1. 59g和NaHC03 2. 93g ;洗滌緩沖液為pH7. 4的磷酸鹽緩沖液，每升溶液中含NaCl 8. 0g， KC1 0? 2g，KH2P04 0? 24g，Na2HP04 ? 12H20 3. 628g，進一步可含吐溫-200. 5mL ;封閉液為含 lmg/mL牛血清白蛋白的pH7. 4的上述磷酸鹽緩沖液；終止液為2mol/L的硫酸。
[0015] 本發明還提供上述任一所述的ro-1抗體檢測試劑盒在PD-1抗體檢測上的應用。 具體地，該應用可以體現在科研實驗中對ro-i抗體濃度的測定、PD-1抗體臨床應用中的藥 物代謝動力學研宄等。
[0016] 本發明還提供一種ro-i抗體檢測方法，采用上述的ro-i抗體檢測試劑盒進行，所 述ro-i抗體檢測方法包括如下順序進行的步驟：
[0017] 1)將所述ro-i細胞膜外結構域的重組蛋白預包被在所述固相載體上，制得預包 被固相載體；
[0018] 2)向所述預包被固相載體中加入待測樣本，孵育，隨后洗滌；
[0019] 3)向所述預包被固相載體中加入所述標記抗體，孵育，隨后洗滌；
[0020] 4)向所述預包被固相載體中加入顯色液，孵育，隨后加入終止液，并測定0D45Q。
[0021] 可以理解的是，如所采用的試劑盒中抗體捕獲劑預包被在固相載體上形成預包被 固相載體，則檢測方法可省略上述步驟1)。
[0022] 進一步地，所述ro-i抗體檢測試劑盒還包括ro-i抗體標準品，所述ro-i抗體檢 測方法還包括：
[0023] 對所述ro-i抗體標準品進行梯度稀釋，并采用步驟1)至步驟4)測定各梯度稀釋 液的〇d45(i，得到ro-i抗體標準品濃度與od45(i的線性關系；
[0024] 根據所測定的待測樣本的〇〇45(|和所述線性關系，得到所述待測樣本中ro-i抗體 的濃度。
[0025] 進一步地，可以采用如下方法制備所述預包被固相載體：
[0026] 采用包被緩沖液對所述ro-1細胞膜外結構域的重組蛋白進行稀釋，控制稀釋后 的重組蛋白溶液的濃度不低于15. 625ng/mL，將稀釋后的重組蛋白溶液加入到所述固相載 體上進行包被；
[0027] 包被結束后，采用洗滌緩沖液對固相載體進行洗滌，隨后向固相載體中加入封閉 液進行封閉，封閉結束后洗滌并干燥，制得所述預包被固相載體。