一種基于攜帶His標簽重組抗原的發光免疫檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫學檢驗專業的抗體檢測技術領域，主要包括過敏原抗體、病原體抗 體和自身抗體，尤其是涉及一種基于攜帶His標簽重組抗原的發光免疫檢測方法。
【背景技術】
[0002] 免疫化學（抗原-抗體反應）技術是檢測特異性抗體的重要方法，即采用已知抗 原檢測未知抗體方式。酶聯免疫吸附試驗（ELISA)間接法常用于檢測上述抗體，也可采用 酶聯斑點印跡試驗（dot-ELISA)以"線性方式"同時包被多種相關抗原，以實現同時檢測多 種抗體（如抗核抗體譜、HIV感染確認試驗等）。上述兩種方法的基本原理如下：用已知抗 原包被固相載體（聚苯乙烯微孔板或硝酸纖維素膜）；加待檢血清溫浴，待檢抗體與已知抗 原結合形成免疫復合物（或待檢抗體被固相抗原捕獲）；再加酶標記抗體并溫浴，標記抗體 與待檢抗體結合，未結合抗體通過"洗滌"去除；最后加底物顯色，終止酶促反應后用酶標儀 讀取吸光度值（A)或直接觀察膜表面斑點判定結果。
[0003] 實際應用中發現上述方法存在一些技術方面的缺陷，而這些缺陷影響檢測結果準 確性或給商業化生產帶來某些困難，主要表現在以下方面：
[0004] 其一、固相化問題固相吸附分離是非均相酶免疫分析常用分離技術，其原理是將 抗原固相在固相材料表面（聚苯乙烯微孔或硝酸纖維膜），與待檢抗體和酶標抗體形成的 抗原-待檢抗體-酶標抗體復合物存在于固相材料表面，而游離標記物分布于液相中。傾 倒液相溶液并通過"洗滌"可輕松去除干擾測定的、游離的酶標記抗體。然而，已知抗原與 固相材料連接后（包被），分布于固相材料表面的抗原分子，其結構不再具有液相中的天然 構象。這種分子構象的變化必將影響已知抗原與待檢抗體結合；同時，固相抗原位于固相材 料表面，因空間位阻效應會嚴重影響與待檢抗體結合。此外，當包被抗原為分子量較小的多 肽分子時，常會因包被過程失去其生物活性，或結合抗體能力顯著下降。
[0005] 其二、包被抗原純度和多種抗原組合的問題固相包被是將抗原包被在固相平面 上，微孔板或硝酸纖維膜的包被面積有限，用于包被的抗原要求較高的純度，而抗原純化過 程會增加檢測試劑盒的生產成本。同時，無論過敏原slgE抗體，還是病原體抗體或自身抗 體，一般需要多種蛋白作為已知抗原，而上述固相包被方式并不適合多重抗原同時進行包 被。多重抗原包被涉及組分之間比例和空間位阻造成的相互干擾。
[0006] 其三、制備過程和使用過程復雜無論酶聯免疫吸附試驗還是酶聯斑點印跡試驗， 抗原固相化過程是診斷試劑生產的關鍵環節，抗原包被-封閉-干燥等過程較復雜，實現標 準化需要標準操作程序并嚴格執行。從用戶角度看，上述兩種檢測試劑的使用也比較復雜， 臨床標本需要稀釋、兩次溫育和多次洗滌過程需要很長時間，且標記抗體（酶）受多種因素 影響等，也不利于操作者的使用。
[0007] 針對上述技術方面的缺陷，本技術發明涉及一種基于攜帶His標簽的已知重組抗 原，采用活性氧能力傳遞均相發光免疫分析原理，建立一種新型發光免疫分析體系，用于特 異性IgE、病原體抗體和自身抗體檢測。
【發明內容】
[0008] 有鑒于此，本發明旨在提出一種基于攜帶His標簽重組抗原的發光免疫檢測方 法，采用活性氧能量傳遞均相發光免疫分析原理，將已知重組抗原置于液相三維空間，與 傳統技術固相化抗原存在本質區別，本發明建立一種新型發光免疫分析體系，用于特異性 IgE、病原體抗體和自身抗體檢測，具有更高的分析敏感度和精密度，且制備工藝簡單，操作 方便。
[0009] 為達到上述目的，本發明創造的技術方案是這樣實現的：
[0010] 一種基于攜帶His標簽重組抗原的發光免疫檢測方法，包括如下步驟，
[0011] 1)獲得His-重組蛋白；
[0012] 2)將待檢血清、His-重組蛋白溶液、His抗體包被的發光微球溶液充分混勻，并于 37°C 溫浴 30 ~45min;
[0013] 3)溫浴后，經高速離心10~15分鐘，棄上清；
[0014] 4)加入生物素標記的第二抗體溶液和鏈霉親和素包被的感光微球溶液，充分混 勻，37°C 溫浴 15 ~30min;
[0015] 5)用光激發發光檢測儀在615nm下檢測光信號。
[0016] 所述His-重組蛋白，上游（左端）攜帶His標簽，下游是待檢抗體所針對的重組 蛋白（已知抗原），重組蛋白帶有不同抗原表位（如圖示含有3種抗原表位），此重組蛋白 可捕獲待檢抗體。
[0017] 所述生物素標記的第二抗體，標記有生物素分子，因待檢抗體為人免疫球蛋白，可 使用兔抗人IgE (用于檢測IgE類抗體）或兔抗人IgG (用于檢測IgG類抗體）。
[0018] 所述鏈霉親和素包被感光微球，感光微球與生物素結合，同時攜帶感光物質，用激 光照射時可產生活性氧分子。
[0019] 所述抗His蛋白包被的發光微球，發光微球與His蛋白結合，同時接受活性氧能 量，可誘導光信號產生。
[0020] 優選的，所述步驟1)中，His-重組蛋白通過以下步驟獲得，根據抗原一級結構合 成目的DNA，并經分子生物學技術將目的基因與攜帶His標簽的表達質粒重組，轉染合適宿 主進行目的蛋白的表達，再經鎳親和層析柱初步純化獲得His-重組蛋白，此物質作為已知 抗原用于檢測抗體。
[0021] 優選的，所述步驟2)中，三種物質混合均勻后，在37°C下溫浴30~45min。
[0022] 優選的，所述步驟2)中，待檢血清、His-重組蛋白混合溶液、His抗體包被的發光 微球的體積比為1:1:1 ;且待檢血清是用Tirs-HCl溶液按照體積比為1:10~20進行稀釋 處理的，優選的，1:10。
[0023] 所述His-重組蛋白混合溶液、His抗體包被的發光微球溶液的稀釋比例根據待測 抗體的類型而定。
[0024] 優選的，所述步驟3)中，高速離心速度為10X 103r/min，且高速離心的時間為 10min〇
[0025] 優選的，所述步驟4)中，生物素標記的第二抗體、鏈霉親和素包被的感光微球與 待檢血清的體積比為2 :4 :1。
[0026]優選的，所述步驟4)中，所述生物素標記的第二抗體為兔抗人IgE或兔抗人IgG 中的一種。
[0027]本發明還提供了一種如上所述的基于攜帶His標簽重組抗原的發光免疫檢測方 法在特異性IgE檢測中的應用。
[0028]本發明也提供了一種如上所述的基于攜帶His標簽重組抗原的發光免疫檢測方 法在病原體IgG或IgM檢測中的應用。
[0029]本發明同時提供了一種如上所述的基于攜帶His標簽重組抗原的發光免疫檢測 方法在自身抗體IgG檢測中的應用。
[0030]本發明還提供了一種用于如上所述的基于攜帶His標簽重組抗原的發光免疫檢 測方法的試劑盒，其中試劑盒包括生物素標記的第二抗體、鏈霉親和素包被的感光微球、生 物素標記第二抗體、攜帶His標簽的重組蛋白。
[0031]本發明基于攜帶His標簽的重組蛋白作為已知抗原、抗His抗體包被發光微球、生 物素標記第二抗體（針對待檢抗體同種型表位的抗體）、鏈霉親和素標記感光微球共同組 成檢測試劑。
[0032]在待檢抗體存在情況下，待檢抗體與重組蛋白形成免疫復合物，此復合物再通過 上游的His與His抗體包被的發光微球結合，通過待檢抗體與生物素標記第二抗體結合， 并經生物素與鏈霉親和素標記的感光微球結合。借助上述反應過程，感光微球和發光微球 相互靠近，距離小于200納米，滿足活性氧傳遞光激化