一種龍虎人丹植物藥中的14種不揮發性成分的含量檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及中藥成分的含量測定方法及其質量控制方法，具體涉及龍虎人丹植物 藥的含量檢測法及其質量控制方法。
【背景技術】
[0002] 龍虎人丹（國藥準字Z20025168)創制于1909年，由黃楚九先生根據古方"諸葛行 軍散"化裁而來，主要由薄荷腦、丁香、肉桂、兒茶、甘草等十一味中藥構成，其功能主治為清 暑開竅，辟穢排濁，驅風健胃。1923年"龍虎牌"和"人丹及圖案"商標向政府申請并獲核 準，成為國內第一個規范的醫藥注冊商標，是上海乃至中國的民族制藥工業發端的標志。百 年來龍虎人丹產品銷售經久不衰，成為銷售過億的獨家傳統中藥品種。
[0003] 由于龍虎人丹由中藥制成，受到藥物產地、采收季節及制備工藝等多種因素的影 響，制成的制劑在確保療效一致性上具有較大難度。因此，有必要對龍虎人丹植物藥的成分 的組成和含量進行嚴格的質量控制。目前，關于龍虎人丹的質量控制方法主要有顯微鑒別、 薄層鑒別、高效液相色譜法和氣相色譜法，張玉杰等利用氣相色譜法測定其中冰片、薄荷腦 的含量，上述方法只針對龍虎人丹中的單個成分，檢測時間較長，樣品檢測前處理步驟復雜 等。到目前為止，未見有關龍虎人丹中同時檢測多種成分的研究報道，無該復方中（1)兒茶 素、（2)表兒茶素、（3)夏佛托苷、（4)甘草苷、（5)異甘草苷、（6)甘草素、（7)刺甘草查爾 酮、（8)甘草酸、（9)異甘草素、（10)胡椒堿、（11)甘草查爾酮A、（12)木香烴內酯、（13)去 氫木香內酯、（14)甘草次酸的同時測定方法。
【發明內容】
[0004] 本發明的主要目的是利用液相色譜-LCQ離子阱質譜聯用技術，對龍虎人丹植物 藥中14種不揮發性成分進行定性定量分析，確保產品質量穩定。
[0005]本發明所采用的技術方案：
[0006] -種龍虎人丹植物藥中14種不揮發性成分含量的檢測方法，該方法由以下步驟 組成：
[0007] (1)配制供試品溶液：取龍虎人丹植物藥用溶劑配制成0.3~2mg /ml的供試品 溶液；
[0008] 配制對照品溶液：精密稱取對照品適量，置于10mL容量瓶中，用溶劑溶解并稀釋 至刻度。搖勻，得各對照品儲備液，置于4°C冰箱保存。
[0009]精密量取各儲備液適量，用乙腈-水（30 : 70,v / v)稀釋,得各對照品的混合標 準溶液。
[0010] 按進樣量為1~20 i! L對Thermo BDS Hypersil C18色譜柱進樣，控制柱溫為 20°C~40°C，接著用由A相和B相組成的流動相以0. 2~1. 5mL / min的速度按照表1的 程序進行梯度洗脫，同時利用液相色譜-LCQ離子阱質譜聯用技術檢測洗脫液，獲得供試品 藥物及對照品藥物的離子色譜圖；
[0011]表 1
[0013] (2)所得對照品溶液的離子色譜圖從左至右分別為兒茶素、表兒茶素、夏佛托苷、 甘草苷、異甘草苷、甘草素、刺甘草查爾酮、甘草酸、異甘草素、胡椒堿、甘草查爾酮A、木香烴 內酯、去氫木香內酯、甘草次酸，供試品的離子色譜圖與對照品溶液的圖譜此較，相應成分 的保留時間相同的峰即是與該成分相同物質的特征峰，每個成分按表4內的標準曲線計算 含量；
[0014]表 4
[0016] (1)兒荼素、（2)表兒荼素、（3)夏佛托苷、（4)甘草苷、（5)異甘草苷、（6)甘草素、 (7)刺甘草查爾酮、（8)甘草酸、（9)異甘草素、（10)胡椒堿、（11)甘草查爾酮A、（12)木香 烴內酯、（13)去氫木香內酯、（14)甘草次酸
[0017] 上述步驟中，
[0018] 配制供試品溶液或對照品溶液所用的溶劑為20~40%的乙腈，或者是與之流動 性相似的溶劑；
[0019] 所述流動相A相為純水含0? 005~0? 015%甲酸（含0? 2mM甲酸銨）；
[0020] B相為乙腈；
[0021] 實驗中質譜條件為：LCQ離子阱質譜，離子源為ESI，離子噴霧電壓5000V(+)、 4500V (-)，鞘氣壓30psi，輔助氣壓5psi，毛細管電壓26V (+)、-37V (-)，毛細管溫度300°C。 掃描方式為全掃描模式。
[0022] 本發明中供試品溶液的制作方法為：龍虎人丹粉碎成細粉，稱取龍虎人丹粉末 30mg，加30 %乙腈lOmL，超聲處理20min，稱定重量，補足所失重量，12000rpm離心10min后 取上清，進樣。
[0023] 本發明中供試品溶液的制作方法還可以采用加熱回流法，即龍虎人丹粉碎成細 粉，稱取龍虎人丹粉末30mg，加10mL20-40 %乙腈，加熱回流20-30min，10000-15000rpm離 心lOmin后取上清，進樣。
[0024] 本發明中優選的梯度洗脫程序如表2。
[0025]表 2
[0027] 本發明中最優選的梯度洗脫程序如表3。
[0028]表 3
[0030] 本發明中在供試品配制過程中的稀釋溶劑為30%的乙腈。
[0031] 本發明中在供試品溶液的制作過程中所使用的乙腈溶劑濃度可以放寬范圍至 20-40%。
[0032] 本發明中可以使用丙酮、甲醛或乙二醇代替供試品溶液的制作過程中所使用的乙 腈溶劑。
[0033] 本發明中可以使用丙酮、甲醛或乙二醇代替供試品溶液的加熱回流法制作過程中 所使用的乙腈溶劑。
[0034] 本發明中對照品溶液配制過程中稀釋劑乙腈-水的此例可選擇為20-40%。
[0035] 本發明中在配制對照品溶液過程中可以使用丙酮或甲醇替代稀釋溶劑乙腈。
[0036] 本發明中在配制供試品溶液中的流動相A為純水含0. 01%甲酸（含0. 2mM甲酸 銨）。
[0037] 本發明方法測試中發現14種成分的標準曲線、定量限和檢測限、各成分的檢測離 子見表4,結果表明在一定濃度范圍內十四種成分的線性關系良好。
[0038]表 4
[0039]
[0040] (2)兒茶素、（2)表兒茶素、（3)夏佛托苷、（4)甘草苷、（5)異甘草苷、（6)甘草素、 (7)刺甘草查爾酮、（8)甘草酸、（9)異甘草素、（10)胡椒堿、（11)甘草查爾酮A、（12)木香 烴內酯、（13)去氫木香內酯、（14)甘草次酸
[0041] 本發明方法中的精密度試驗結果為14種成分的RSD〈4. 46%，表明精密度良好。準 確度考察結果見表5,14種成分的回收率在94. 41-103. 39%之間，RSD〈6. 05%，表明準確度 良好。
[0042]表 5
[0044] (1)兒茶素、（2)表兒茶素、（3)夏佛托苷、（4)甘草苷、（5)異甘草苷、（6)甘草素、 (7)刺甘草查爾酮、（8)甘草酸、（9)異甘草素、（10)胡椒堿、（11)甘草查爾酮A、（12)木香 烴內酯、（13)去氫木香內酯、（14)甘草次酸
[0045] 本發明方法中的重現性結果見表5, RSD在0. 66-4. 99%之間，結果表明樣品重現 性良好。
[0046] 穩定性考察顯示，4°C條件下，龍虎人丹樣品溶液至少24h內穩定（RSD〈4. 69%)。
【附圖說明】
[0047] 圖1為總離子色譜圖，其中A:在負離子模式下的混合對照品圖；B:正離子模式下 的混合對照品圖；C:負離子模式下的樣品圖；D:正離子模式下的樣品圖；（1)兒茶素、（2) 表兒茶素、（3)夏佛托苷、（4)甘草苷、（5)異甘草苷、（6)甘草素、（7)刺甘草查爾酮、（8)甘 草酸、（9)異甘草素、（10)胡椒堿、（11)甘草查爾酮A、（12)木香烴內酯、（13)去氫木香內 酯、（14)甘草次酸。
[0048] 圖2為對照品A和樣品B中的提取離子色譜圖：⑴兒茶素、⑵表兒茶素、⑶夏 佛托苷、（4)甘草苷、（5)異甘草苷、（6)甘草素、（7)刺甘草查爾酮、（8)甘草酸、（9)異甘草 素、（10)胡椒堿、（11)甘草查爾酮A、（12)木香烴內酯、（13)去氫木香內酯、（14)甘草次酸
【具體實施方式】
[0049] 以下結合實施例對本方面做進一步的描述。
[0050] 實施例一