一種基于絲網印刷電極的四環素適配體傳感器制備及檢測方法
【專利說明】 —種基于絲網印刷電極的四環素適配體傳感器制備及檢測
方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種基于絲網印刷電極的適配體傳感器制備及檢測方法，屬于農產品安全檢測技術領域。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著我國畜牧養殖業的迅速發展，奶產量大幅度提高，新鮮牛奶和奶制品已經成為人民(尤其是老人和兒童)生活食品中的重要組成部分。抗生素被廣泛用于預防及治療奶牛疾病，由于頻繁、超劑量使用，使得牛奶等動物源食品中存在一定量的抗生素殘留。長期飲用或食用有抗生素殘留的牛乳或乳制品，也就相當于長期低劑量的攝入抗生素，從而使人體腸道內的正常菌群受到抑制，導致致病菌大量繁殖引起全身或局部感染。由于奶牛乳腺炎發病率較高，用四環素來治療乳腺炎等產科疾病仍較普遍，這容易導致在牛奶中四環素的殘留。過量使用四環素類抗生素不可避免會使母體代謝產物等相關抗生素殘留于動物的肌肉、蛋、奶、臟器組織中，進而通過食物鏈影響人體健康。牛奶中含有抗生素殘留，不僅對人的健康造成很大的危害，而且對乳品加工企業帶來重大經濟損失。因此必須嚴格控制牛奶中抗生素殘留，除了要做好科學飼養、精心管理、正確擠奶和預防疾病外，還要規范抗生素的使用。因此要避免上述情況的發生，除了從源頭上控制抗生素的使用外，及時、準確地檢測出動物源食品中的抗生素殘留是保障畜產品安全的有效途徑。可見，加強對牛奶等農產品中抗生素殘留的檢測，尤其是保障人類健康有著十分深遠的意義。
[0003]傳統的抗生素殘留檢測方法主要有:氣相色譜(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜/質譜聯用技術(GC/LC-MS)、毛細管電泳法(CE)、熒光分析、酶聯免疫法(ELISA)。這些方法雖然選擇性好、靈敏度高、準確度高、檢出限低，可同時檢測多種元素或化合物，但其需要昂貴的儀器設備，樣品前處理過程繁瑣、費時，并且對分析人員的技術水平要求很高，不適于現場快速檢測。核酸適配體(Aptamer)是人工合成的核酸序列，經多次篩選獲得的核酸適配體與靶分子有很高的特異性和親和力。而且適配體是由體外篩選和擴增獲得的，不需要免疫動物或培養細胞，具有極好的準確性和重復性，很高的純度，可以避免產生批間差異。另外，核酸適配體無免疫原性，可在不同溫度、不同離子濃度、金屬螯合劑存在條件下反復變性和復性，在合成過程中，各種報告分子(熒光素或生物素)和功能集團可精確地結合在適配體位點上。目前用抗體進行檢測和診斷的技術幾乎可以全部由適配體來代替。抗生素是小分子半抗原物質，難以制備相應的抗體，即使制備出相應的抗體，也存在免疫傳感器的信號弱、重復使用性差、重現性不能滿足實際樣品檢測的要求等問題。核酸適配體就可以很好的解決這個問題。與傳統的分析方法相比，適配體具有如下特點:(I)較高的選擇性，因此不需要對被測組分進行分離，即不用對樣品進行預處理。(2)結構簡單，體積小，使用方便，特別是便攜式的免疫傳感器，非常有利于農產品安全質量的快速測定。(3)可實現連續在線檢測，使食品加工過程的質量控制變得簡便。(4)響應速度快，樣品用量少，與其他大型分析儀器相比，免疫傳感器制作成本低，且可反復使用。
[0004]本發明的目的在于克服上述現有技術存在的不足，提供了一種結構簡單、操作方便、成本低且檢測靈敏度高的絲網印刷電極適配體傳感器制備方法及檢測方法。
【發明內容】
[0005]其技術方案為:一種基于絲網印刷電極的適配體傳感器制備及檢測方法，其特征在于:在由離子液和四氧化三鐵逐層修飾的絲網印刷電極表面，滴涂四環素適配體，制備四環素適配體傳感器，將四環素適配體傳感器用于牛奶中四環素殘留的現場快速檢測。
[0006]為實現以上功能，本發明的一種基于絲網印刷電極的適配體傳感器的制備方法為:(1)所述的離子液的制備方法如下:將4mg N-辛基吡啶六氟磷酸鹽(離子液體)分散于4mL無水乙醇中，超聲分散6小時以得到穩定的分散液，所獲得的高度分散懸浮液為lmg/mL離子液體溶液，將制備好的離子液體溶液在4 °0下存儲。(2)所述的四氧化三鐵的制備方法如下:稱取ImL乙酸溶液于小燒杯中，加入10mL超純水配成1.0%乙酸溶液。在50mL乙酸溶液中加入0.1g殼聚糖，配成0.2%殼聚糖溶液。取4mL 0.2%殼聚糖溶液，加入Img四氧化三鐵粉末，超聲分散6h以上得到穩定的分散液。(3)適配體在絲網印刷電極表面的固定:在絲網印刷電極表面滴涂6 μ L 0.5mg/mL離子液體，待表面自然晾干后，接著滴涂6 μ L0.25mg/mL四氧化三鐵溶液，自然晾干，最后在絲網印刷電極上滴加15 μ L的5mM的適配體，在室溫條件下使其自然晾干，保存在4° C條件下備用。
[0007]所述的一種基于絲網印刷電極的適配體傳感器制備及檢測方法，其特征在于:絲網印刷電極的清洗與活化，基于絲網印刷電極的適配體傳感器的制備及過程表征(制備離子液和四氧化三鐵納米材料，利用離子液和四氧化三鐵的協同作用共同修飾電極)，適配體傳感器工作曲線的建立，適配體傳感器性能的檢測，適配體傳感器對實際樣品的檢測。
[0008]所述的一種基于絲網印刷電極的適配體傳感器制備及檢測方法，其特征在于:實驗條件的優化，主要包括適配體濃度、測試底液的PH以及測試時間和溫度；所制備的適配體傳感器的工作曲線為:ΔΙ (μA)= 0.8881 LogC (M)+10.710 (R2= 0.9687);適配體傳感器性能檢測包括重現性、穩定性、再生性、特異性以及適配體傳感器對牛奶樣品回收率的測定。其制備原理為:適配體生物傳感器以適配體作為識別元件，通過固定化技術將適配體結合到感受器表面，適配體與目標物結合后，形成的復合物與產生的物理或化學信號相關聯，由換能器將其轉化為與待測物質濃度(或活度)有關的可定量或者可處理的物理化學信號，再通過二次儀表放大并且輸出信號，從而實現對待測物質的檢測。本發明采用離子液-四氧化三鐵復合物修飾電極，離子液體電導率高，電化學窗口大，離子液體可替代傳統有機溶劑或酸堿成功用作化工反應和分離的新介質，由于離子液體具有導電性、難揮發、不燃燒、電化學穩定電位窗口比其它電解質水溶液大很多等特點；Fe304磁性納米顆粒可在電極表面形成一層薄膜，增大電極面積，同時可將氧化還原活性物質運輸到電極表面。因此使用Fe3O4磁性納米粒子修飾電極后，大大提高與生物分子的結合能力，進而將生物分子很好的固定到電極表面，提高傳感器檢測的靈敏度；因此采用離子液-四氧化三鐵復合物不僅可促進電極與測試底液直接的電子傳遞，實現信號的放大，而且離子液和四氧化三鐵有很好的生物相容性，為適配體在電極表面的固定提供了一個良好的生物界面，保持了適配體的生物活性以用來和目標物進行有效的結合。采用本發明一種基于絲網印刷電極的適配體傳感器制備及檢測方法，可用于牛奶中抗生素殘留現場快速檢測，可以在牛奶上市前，進行四環素殘留的快速測定，直接對四環素殘留量是否超標進行檢測，避免因食用含有四環素的牛奶而引起四環素在人體內的蓄積造成嚴重的后果，為畜牧產品安全生產與消費提供殘留檢測的技術支撐。
[0009]本發明所用絲網印刷碳電極制作簡單，具有能夠實現批量生產、電極集成、樣品用量小、成本低且一次使用可拋棄的優點，避免了共用同一電極檢測多個樣本時的交叉干擾問題，為生物傳感器走向廉價、大規模應用提供了一種具有前景的途徑，很好地解決了當前電極預處理的繁瑣程序，且同批次電極具有很好的同一性，可以批量生產，實現商品化。
[0010]所述絲網印刷碳電極，包括印制電極的基片，印制于基片上的外部絕緣層和至少兩根電極引線，基片印制有三個電極，分別為一個工作電極、一個對電極及一個參比電極，各電極對應連接有一電極引線。
[0011]所述清洗、活化絲網印刷碳電極，過程是:首先，將絲網印刷碳電極置于NaOH溶液中超聲，超純水沖洗，N2吹干，其次，將電極置于HCl溶液中超聲，超純水沖洗，N2吹干，再次，用無水乙醇沖洗電極，N2吹干，最后，在磷酸鹽緩沖液中掃描電流-時間曲線，之后掃描循環伏安曲線直至性能穩定。
[0012]所述的一種基于絲網印刷電極的適配體傳感器制備及檢測方法，其特征在于:對裸絲網印刷電極、離子液-四氧化三鐵修飾的絲網印刷電極，以及復合物修飾電極后固定適配體、適配體傳感器結合四環素后的逐步修飾過程進行循環伏安(CV)表征。循環伏安測試是在-0.2-0.6V，掃速為0.05V/S的條件下進行，其測試底液為含5mmol/L[Fe (CN)6J3^P 0.lmol/L KCl的混合液的0.lmol