篩選土壤活性細菌和成份的紙基微流控芯片及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及活性細菌的微生物篩選和進一步的活性成份篩選，特別涉及篩選土壤活性細菌和成份的紙基微流控芯片制備及應用，主要是一種在紙上絲網套印包括樣本細菌-模型細菌的對偶微室共同培養、分離成份部位-模型細菌的對偶微室、2-維電泳以及細菌呼吸電化學測量陣列等單元的紙基2-維電泳微流控芯片。
【背景技術】
[0002]1928年Alexander Fleming發現青霉素和抑菌環(A.Fleming, 1929，12，226-236)。12年后弗洛里和錢恩分離得到第一個臨床應用抗生素青霉素。Lewis (K.Lewis, 2012, 485, 439-440)指出，在抗生素發現黃金時代(40?60年代)大多數抗生素從土壤源放線菌中被篩選出來，但該法收益遞減，20年后這類方法和平臺卻不靈了，隨后從合成化合物篩選，也因多數缺乏透過細菌包膜能力也努力失敗。他強調思考抗菌發現的黃金時代，不要放棄過去成功的篩選土壤細菌的方法。
[0003]當前在環境污染抗性細菌普遍出現和繁衍的情況下，唯有采用現代先進技術才能保持我們期望的抗菌素耐藥和新藥發現的平衡，從而使往日成功得以復制。Kaeberlein等設計了一個模擬海洋沉積物在0.03 μ m孔徑聚碳酸醋膜間形成微生物擴散生長室，來孵育不可培養的(野生)海洋微生物的自然生長(T.Kaeberlein etal.，2002，296，1127—1129) Jichols (D.Nichols et al.，2010，76，2445-2450)等使用一種新型隔離芯片，原位地、高通量地從不同環境中分離、并培養了 ‘野生’微生物物種。這種芯片包含數百個可接種單個細胞的微擴散室，形成龐大且多樣的陣列排布，能夠發現先前難以培養的微生物。Huacca等采用聚二甲基硅氧烷PDMS噴墨打印紙基便攜裝置來培養細菌(M.F.Huacca et al.，2012，12，4269-4278)。但是，這些芯片都沒有包含陣列樣本細菌-模型細菌對偶微室這樣的活性細菌篩選單元，也不涉及活性細菌的次生代謝產物經過2-維分離后的陣列活性成份篩選單元。
[0004]目前，復雜抗生素樣品(如細菌次級代謝物)通常采用毛細管電泳-質譜(P.1.Koczka et al.，2014，35，2534-2537)或液相色譜-質譜(M.Gbylik-Sikorska etal.，2015，119,8-15)分離檢測；微流控芯片包括紙基微流控芯片(E.K.Sackmann etal.，2014，507，181-189)包含自動進樣、樣品預處理等多個功能也被廣泛應用于復雜樣品(如活性細菌次級代謝產物)的分離和檢測；Shameli等基于2_維微流控芯片分離蛋白質并采用熒光標記蛋白進行檢測(S.M.Shameli et al.，2015，87，3593-3597)。2007年Martinez等提出光刻法實現復雜圖案的親水區域和通道，并利用紙基自動虹吸輸液的紙基微流控芯片(A.ff.Martinez et al.，2007，46，1318-1320)。其實，Gross 早在 1959 就采用2-維紙基平板電泳分離和苦味酸色包含至少27種氨基酸和酰胺的復雜生物樣品(DK.D.Gross, 1959，184，1298-1301)。上述文獻說明，2-維紙基平板電泳特別是具有相間電泳通道(有降低焦耳熱的優點)的2-維垂直通道的紙基電泳芯片應該具有強大的分離復雜生物樣品(如活性細菌次級代謝產物)的能力，但通過質譜、熒光標記蛋白或苦味酸染色檢測等都不能直接地(原位地)篩選成份的活性。
[0005]紙基電化學傳感器作為測向流動和微流控裝置，其便宜、快速、靈活和容易使用在及時檢測中得到越來越多的應用(B.W.Liu et al.，2014，26，1214-1223)。Wang等把大腸桿菌固定到普通碳電極，通過氫醌陽極電流指示毒物影響細菌呼吸程度(H.Wang etal.，2008, 19，211-214) ；Yu等在重金屬毒物和苯醌溶液環境孵育大腸桿菌，用鉑微電極工作電極-飽和KCl溶液Ag/AgCl參比電極-鉑絲對電極反映毒物毒性的氫醌陽極電流(D.B.Yu et al.，2013，138，3297-3302)。
[0006]申請號為201410392974.9的中國發明專利，公開了一種紙基微流控芯片陽極電流檢測水污染物生物毒性的方法，該方法基于微生物呼吸鏈-對氫醌體系電化學檢測原理，在絲網印刷PDMS親水微通道和碳漿三電極系統的紙基微流控芯片上，但是該專利不能用于篩選土壤活性細菌和成份，因此，必須發展高自動化程度、高通量、低成本、全程一體化的微流控平臺技術，才能實現在污染抗性環境下土壤細菌新抗菌素的有效地篩選。
【發明內容】
[0007]針對污染土壤抗生素活性細菌和活性抗生素組份獲取的難度大、概率低、費時費力的缺陷，本發明的目的在于提供一種篩選土壤活性細菌和成份的紙基微流控芯片制備及應用，通過在色譜紙上多次套印細菌-明膠陣列培養、PDMS 2-維電泳、碳漿電泳電極和電化學三電極陣列單元得到紙基微流控芯片，再利用陣列對偶的樣本細菌-模型細菌紙基微室共同培養篩選土壤樣本抗生素活性細菌，再在利用2-維垂直通道的紙基電泳以及均勻分布在紙基2-維平面的分離成份部位-模型細菌的陣列微室，來原位地捕獲或發現2-維分離的活性成份。
[0008]為了達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的:
[0009]篩選土壤活性細菌和成份的紙基微流控芯片制備，包括如下步驟:
[0010]步驟一、設計多功能紙基微流控芯片
[0011 ] (1.1)、設計第一維的等電聚焦電泳IEF分離通道2，該通道與左側緩沖液池3和右側緩沖液池4相連，在該通道左側緩沖液池3的紙基背面設計進樣紙條25并與緩沖液26相連，再在該通道右側緩沖液池4的紙基背面設計進樣紙條25并與緩沖液26相連，并在該通道的左側設計碳漿(+)電極5和右側設計碳漿(_)電極6 ;
[0012](1.2)、設計紙基陣列活性細菌篩選功能單元1，該陣列功能單元緊鄰IEF分離通道2上方，并沿該通道緊密地陣列分布；
[0013](1.3)、設計第二維的豎直、平行且間隔、陣列的毛細管區帶電泳CZE分離通道7，該陣列通道位于第一維IEF分離通道2的下方，而且垂直并連接IEF分離通道2的不同位置，平行陣列CZE分離通道7的上方共用碳漿⑴電極8和下方的共用碳漿㈠電極9，在每個CZE通道7上方與IEF分離通道2垂直連接的紙基背面各個位置C1+，C2+，...處設計進樣紙條25，進樣紙條25并與緩沖液26相連，作為該陣列CZE的(+)極緩沖液池；同理，在CZE通道下方的紙基背面各個位置Cw C2_，...處也設計進樣紙條25并與同樣緩沖液26相連，作為該陣列CZE的(-)極緩沖液池10，以保證不同位置的已完成IEF第一維分離并分布于不同位置的活性細菌次生代謝物成份迅速進入鄰近的相應CZE通道7，開始CZE第二維分離；
[0014](1.4)、設計紙基陣列活性成份篩選單元11，該功能單元是沿各陣列CZE分離通道7左側最大緊密地陣列均勻排布的，在完成CZE活性細菌次生代謝產物第二維分離后，在2-維分離和模型細菌紙基層I的下層另外加一層模型細菌紙基層II，使得獨立陣列模型細菌培養室15陣列分布于CZE分離通道7正下方，并通過緊密接觸使對應位置的活性成份篩選單元11與CZE分離通道7導通，保證CZE分離通道7經2-維分離的、各個位置的次生代謝產物成份獨立地擴散到其鄰近的各個陣列活性成份篩選單元11里面；
[0015](1.5)、設計最下層的培養基-陣列電極紙基層III，該紙基層III包含著獨立陣列的培養基供給單元，每個供給單元包括了直道的培養基供給通道12和彎道的培養基供給區13，以及處于紙基層I的模型細菌培養室14和紙基層II獨立陣列模型細菌培養室15的碳楽.三電極結構單元16，楽三電極結構單元16與其上層的陣列活性細菌篩選功能單元I的位置相對應；
[0016]步驟二、制作多功能紙基微流控芯片
[0017](2.1)、絲網印刷碳漿電泳電極、PDMS活性細菌篩選功能單元、2-維分離通道和模型細菌，依據步驟(1.2)和步驟(1.3)的設計制作IEF電極5、IEF電極6和CZE電極8,CZE電極9的絲網印刷網板A，在第一層色譜紙的正面絲網印刷這四個碳漿電泳電極，150°C烘I小時；再依據步驟(1.1)、步驟(1.2)和步驟(1.3)的設計制作陣列活性細菌篩選功能單元I中的模型細菌培養室14和樣本細菌培養室17、IEF分離通道2、緩沖液池3、緩沖液池4、CZE分離通道7和緩沖液池10的網板B，再在第一層色譜紙的背面用質量比8:1的PDMS和正硅酸乙酯TEOS液態膠混合物絲網印刷，形成第一層色譜紙上包含正面的碳漿電泳電極、背面的細菌培養室和2-維分離通道層的結構，滅菌處理；再制作陣列活性細菌篩選功能單元I中的模型細菌培養室14構型的網板C，再在模型細菌培養室14內，在無菌環境下絲網套印