一種定量測定同型半胱氨酸的電化學試紙及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物傳感技術領域，尤其涉及一種定量測定同型半胱氨酸的電化學試紙及其制備方法。
【背景技術】
[0002]同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)又稱高半胱氨酸,是蛋氨酸去甲基后形成的一種含硫氨基酸，屬于蛋氨酸循環的中間產物。有關其代謝紊亂的報道最早來源于先天性胱硫醚合成酶缺乏導致出現同型半胱氨酸尿患者的觀察。此后，又相繼發現其他幾種參與HCY代謝的酶或輔酶改變所引起的代謝紊亂。近幾年來，隨著測定技術方法的改進，已經能夠對正常人血漿中以各種形式存在的HCY進行測定，并且發現在心、腦及外周血管疾病、慢性腎功能不全、牛皮癬、維生素B12缺乏等疾病的患者中存在HCY的代謝紊亂。對同型半胱氨酸的研究始于20世紀70年代，1969年首次提出高同型半胱氨酸血癥可致動脈粥樣硬化并可形成血栓后，人們逐漸發現人體血清中同型半胱氨酸的含量與冠心病、腦血管疾病、外周血管疾病和靜脈血栓的發生和發展有著密切的關系，而且隨著同型半胱氨酸含量的增加發生血管疾病的危險也呈遞增趨勢。
[0003]高同型半胱氨酸通過氧自由基介導引起血管內皮損傷，不同濃度的血清HCY還可通過抑制內皮細胞DNA的合成，影響內皮功能及細胞形態改變，并促使血管平滑肌細胞增殖，導致動脈粥樣硬化。血清HCY可使血小板受損，使血小板的黏附性和聚集性增加。血清HCY尚能改變花生四烯酸代謝，使血栓素A2合成增加，血栓素A2具有收縮血管和促血小板聚集的作用。血清HCY還通過抑制凝血酶調節蛋白在內皮細胞表面的表達及活性，進一步抑制蛋白C的激活，影響凝血酶的滅活。血清HCY還能增加組織因子的活性，激活凝血酶，導致血管系統的血栓少形成。
[0004]目前越來越多的資料顯示HCY與腦血管病有著緊密的聯系。甚至有人認為HCY水平升高是腦血管病的一項獨立危險因素和重要危險因子。研究分析表明，隨著血漿HCY水平的增高，患缺血性腦血管病的相對危險度逐漸增加，與非HCY患者相比，HCY患者患缺血性腦血管病相對危險度增加。此外，研究還發現，不論是缺血性腦血管病患者，還是腦梗死和TIA患者，其血漿HCY水平均高于對照組，提示HCY水平升高可能與缺血性腦血管病的發病密切相關。腦梗死與TIA患者血漿HCY水平相比無顯著性差異，表明HCY水平與缺血性腦血管病的類型可能無關。
[0005]目前有關HCY測定方法有氣相色譜-質譜聯用法、氨基酸分析儀、高效液相色譜法、全自動熒光偏振免疫法、高效毛細管電泳法和酶法等。
[0006]氣相色譜-質譜聯用法:所用的儀器為氣相色譜-質譜儀，標本的處理過程包括:先加入三種內標:同型胱氨酸，胱氨酸和L-(甲基-2H3)蛋氨酸，然后加EDTA-Na2和β-巰基乙醇100°C、15min,再以磺基水楊酸沉淀蛋白，上清液用離子交換柱預處理，氮氣吹干后，用水重新溶解，進行衍生處理后上樣.氣相色譜儀進樣溫度250°C，毛細血管柱箱溫度180°C，以8V /min速度升溫至276°C，柱前端壓力為26psi，以保留時間和質譜進行定性和定量。氣相色譜-質譜聯用法操作十分復雜，耗時長，儀器設備要求高，現除了在某些專門的實驗室進行測定外，普及很困難。
[0007]氨基酸分析儀法和高效液相色譜法:氨基酸分析儀和高效液相色譜法(HPLC)這兩種方法都屬色譜分離技術，HPLC由于其分離的高效率和檢測方式靈敏而更常用一些。HPLC根據所用的色譜柱(反相柱或離子交換柱)、衍生方式(柱前或柱后衍生)、檢測方式(紫外或熒光)又分為多種測定方法。其中以Fiskerstrand等報道的方法較有代表性。血液標本以EDTA-Na2抗凝，(TC _4°C，2000g離心5min，磺基水楊酸沉淀蛋白質，上清液再與NaBH4溶液反應，還原二硫鍵，衍生化試劑為0.025mol/L的Monobromobimane,反應3min后以冰醋酸終止反應。20ul衍生化后的樣本進入一根150mm X4.6mm ODS柱。色譜柱預先以PH3.5的硝酸銨緩沖液平衡，用含有乙腈的流動相進行梯度洗脫，用熒光檢測器激發波長365nm,發射波長475nm檢測。這兩種方法耗時長且不適宜大規模自動化的測定。全自動突光偏振免疫法和高效毛細管電泳法等方法也都存在類似的缺點。
[0008]酶法測定血清同型半胱氨酸反應原理:基于小分了捕獲技術SMT的S-腺苷同型半胱氨酸的方法，這種方法測定迅速、準確，適合醫院內大規模測定樣本。該方法不適合于基層醫院檢驗場所應用，尤其不適合于家庭方式檢測。
【發明內容】
[0009]本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種同型半胱氨酸電化學試紙及其制作方法，使該試紙一旦接觸人體體液后，可在相應的配套測試儀器上方便直觀的讀出測試結果，其制作方法簡單，方便后期加工和封裝，有利于規模化生產。
[0010]本發明的第一個方面是提供一種定量測定同型半胱氨酸的電化學試紙，包括一絕緣基片、設置在絕緣基片上的工作電極和參考電極；所述絕緣基片上設有電回路，在絕緣基片的一端設有與讀出儀表相連的導線，所述工作電極上噴涂有催化血液同型半胱氨酸反應的生物酶，以及一種能在酶催化反應中心和電極之間進行電子傳遞的導電介質和粘合劑。[0011 ] 優選地，所述生物酶為同型半胱氨酸甲基轉移酶或D-蛋氨酸氧化酶。
[0012]優選地，所述工作電極和參考電極均為雙層導電薄膜，包括碳涂層和設置在碳涂層與絕緣基片之間的導電銀層。
[0013]優選地，所述碳涂層中含有1.2-2.5wt%的粘合劑、10_20wt%的導電介質、以及余量的導電碳材料。
[0014]優選地，所述導電介質為苯醌、鐵氰化鉀或二茂鐵甲酸。
[0015]優選地，所述粘合劑為羥乙基纖維素、羥甲基纖維素和聚乙二醇中的一種或多種。
[0016]優選地，所述絕緣基片一種韌性好、絕緣度高的聚合材料，如聚氯乙烯、聚酯或聚碳酸酯。
[0017]工作電極與參考電極靠近，兩個電極構成一個有效反應區域，在同測試儀連接后，組成有效體液成分測試系統。
[0018]本發明的第二個方面是提供一種本發明第一個方面所述的定量測定同型半胱氨酸的電化學試紙的制備方法。采用生物傳感及電化學原理，通過絲網和噴涂印刷相結合的方法制作上述試紙，絲網印刷局限于印制導電線路，僅作為導通，將比較敏感的生物元件從絲印材料中分離，采用非接觸的噴涂方式印刷在電極支持物上，噴涂材料的噴涂量和噴涂面積完全由電腦精確控制。
[0019]所述制備方法包括以下步驟:
[0020]步驟1，導電碳材料的制備:導電碳墨中加入1.2-2.5?丨％的粘合劑，加入10-20wt%的能在酶催化反應中心和電極之間進行電子傳遞的導電介質，混勻備用；
[0021]生物酶液的制備:將生物酶加入到50-120mmol/L的磷酸緩沖液中，同時添加在酶催化反應中心和電極之間進行電子傳遞的導電介質，其中，生物酶的濃度為20-100國際單位/L，導電介質的濃度為200-800mg/L ；
[0022]步驟2，參考電極的制備:通過絲網印刷技術將導電銀材料和導電碳材料印在絕緣基片上，得到參考電極；
[0023]工作電極的制備:通過絲網印刷技術將導電銀材料和導電碳材料印在絕緣基片上，然后噴涂印刷生物酶液，得到工作電極。
[0024]優選地，通過絲網印刷技術將導電銀材料和導電碳材料印在絕緣基片上的具體操作為:
[0025]I)將100-300目數的金屬或尼龍聚酯材料絲網固定在方型輕質金屬框加上，在暗室內涂上感光膠，干燥備用；
[0026]2)將計算機繪制的工作電極和參考電極負片置于感光膠上，于10-30瓦紫外燈下曝光10-20分鐘，用高壓水槍沖洗去被電極負片覆蓋的未硬化感光膠，干燥后形成絲印模板；
[0027]3)將帶有工作電極和參考電極圖形的絲印模板安裝于自動絲印機上備用；
[0028]4)將導電銀材料和導電碳材料印在絕緣基片上。
[0029]優選地，磷酸緩沖液中生物酶為同型半胱氨酸甲基轉移酶，其活性濃度為50-100國際單位/L，或者所述生物酶為D-蛋氨酸氧化酶，其活性濃度為20-50國際單位/L。
[0030]本發明提供的制備方法將絲網印刷局限于印制導電線路，僅起導通作用，從而降低了工藝制作要求；絲印材料和絲印設備不必特殊加工，通過市售渠道即可獲得，成本很低；將比較敏感的生物元件如酶、導電介質和粘合劑等從絲印材料中分離，以非接觸的噴涂方式印刷在電極支持物(工作電極)上，消除了復合絲印方式因反復接觸式印刷對生物敏感材料帶來的不利影響；由于噴涂印刷技術已臻于完善，所要噴涂的材料完全可由電腦精確控制其噴涂量和面積，使最終產品的精度和重復性得到充分保障。本發明試紙一旦接觸人體體液后，可在相應的配套測試儀器上方便直觀的讀出測試結果，制作方法簡單，精度高，成本低，方便后期加工和封裝，有利于規模化生產。
[0031]本發明提供的定量測定同型半胱氨酸的電化學試紙采用酶試劑和印刷電路迭合的結構，試劑穩定性好，電流信號強度高，可使用全血、血清或血漿作為標本，測定人體同型半胱氨酸的含量。試紙成本低廉，操作簡單、快速、靈敏，且特異性好，與一臺掌上型電化學檢測儀配套使用，使用更為方便快捷，尤其適合于急診、病床旁和家庭檢測。
【附圖說明】
[0032]圖1為本發明提供的定量測定同型半胱氨酸的電化學試紙的結構示意圖。
【具體實施方式】
[0033]參照圖1，本發明提供的定量測定同型半胱氨酸的電化學試紙，包括一絕緣基片1，在絕緣基片I上印有工作電極2和參考電極3 ;絕緣基片I上印有電回路，在絕緣基片I的一端設有與讀出儀表相連的導線4。
[0034]工作電極2上噴涂有催化血液同型半胱氨酸反應的生物酶，以及一種能在酶催化反應中心和電極之間進行電子傳遞的導電介質和粘合劑。如此構成一個電路回路，反應時根據血液中同型半胱氨酸濃度的高低，產生相應大小的電流信號，并被測試儀檢測讀出。被測試的物質為同型半胱氨酸，使用的生物酶可以為同型半胱氨酸甲基轉移酶或D-蛋氨酸氧化酶。
[0035]工作電極和參考電極均為雙層導電薄膜5，包括碳涂層和設置在碳涂層與絕緣基片之間的導電銀層。碳涂層中含有1.2-2.5wt%的粘合劑、10