一種裂殖壺菌藻粉中dha含量的測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明是一種裂殖壺菌藻粉中DHA含量的測定方法，具體涉及裂殖壺菌中不飽和 脂肪酸DHA的定量測定，屬于不飽和脂肪酸的檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 脂肪酸是細胞的重要組成部分，不僅為細胞活動提供能量，含有3~5個雙建的多 不飽和脂肪酸還是前列腺素和白細胞三烯的合成前體，據研宄表明，α -亞麻酸、二十碳五 烯酸（ΕΡΑ)、二十二碳六烯酸（DHA)等η-3多不飽和脂肪酸還具有抗發炎、抗血栓、抗心律失 常、降血脂和軟化血管等作用。η-3多不飽和脂肪酸的主要來源有植物油，例如：例如：菠 菜、馬齒莧、亞麻的種子、亞麻仁以及胡桃等，其中以亞麻籽油中含α-亞麻酸（高達57%) 最多，其次是菜籽油、大豆油和小麥胚芽油（7%~13%);其他來源包括一些堅果、種子、 蔬菜和水果、蛋黃、禽肉，其中，魚類是主要的EPA和DHA來源；除此之外，海洋微生物以及 一些藻類植物也是多不飽和脂肪酸的良好來源，裂殖壺菌即是其中一種。
[0003] 裂殖壺菌（Schizochytrium)作為一類藻類的海洋真菌，該菌易培養、生長快，已實 現工業化生產，其細胞內積累了大量的油脂，90%以上油脂以人體易吸收的甘油三脂（TG) 形式存在，不飽和脂肪酸含量很高，主要為DHA，其它多不飽和脂肪酸含量很低。毒性3+試 驗證明使用裂殖壺菌作為食品添加劑飼喂大鼠、兔和豬是安全可靠的，其安全性已得到美 國FDA的認可。目前，壺菌藻粉作為一種理想的DHA新生資源，已廣泛應用于食品、藥品 和保健品。國內外公開報道裂殖壺菌藻粉文獻較多，大多集中在裂殖壺菌的工業化生產、油 脂提取、營養成分分析等，如《裂殖壺菌DHA提取方法的優化和工業化應用》（南京科技大 學，碩士論文，dingweicui，2012. 05)記載的對微生物油脂的提取方法，和《富含DHA的裂殖 壺菌的工業化生產試驗、脂肪酸提取及應用研宄》（中國海洋大學，博士學位論文，宋曉金， 2008. 06. 01)記載的工業化生產及脂肪酸的提取技術，但關于裂殖壺菌藻粉中DHA的定量 測定，尚未見公開報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種裂殖壺菌藻粉中DHA含量的測定方法，該測定方法是 對裂殖壺菌藻粉中提取的油脂進行的氣相色譜檢測，使用氣相色譜內標法定量測定油脂中 的脂肪酸含量，具有樣品處理簡單，操作簡便、快速的特性，測定結果重現性好、可行度高， 并為裂殖壺菌藻粉DHA的質量控制提供了檢測方法依據。
[0005] 本發明通過下述技術方案實現：一種裂殖壺菌藻粉中DHA含量的測定方法，所述 的測定方法包括以下步驟： A :備樣，取標準溶液和裂殖壺菌藻粉樣品，在裂殖壺菌藻粉樣品中加入內標物和鹽酸， 混合后提取油脂，所述的內標物為十三烷酸內標溶液，所述的標準溶液選用Supelco 37種 脂肪酸甲酯混合標準溶液，其濃度為10 mg/mL ; B :制備供試品溶液，將步驟A提取的油脂依次皂化、甲酯化后制得脂肪酸甲酯溶液，在 脂肪酸甲酯溶液中加入異辛烷和飽和NaCl溶液，經混合、靜置分層后，移取上層清液，脫水 后制得供試品溶液，備用； C :測定，分別移取等量的供試品溶液和標準溶液I y L，注入氣相色譜儀中進行測定， 測定條件包括： 色譜柱：石英毛細管柱， 柱溫：60~240°C， 檢測器：氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度：250~270°C， 汽化室溫度：240~260 °C ; 氣體流量：載氣為高純氮，流速〇. 8~I. 2mL/min，空氣流速300~400mL/min，氫氣流 速 30 ~40mT,/min , 分流比：（5~20) :1。
[0006] 本發明方法操作簡便、快速、重復性好，適合于批量裂殖壺菌藻粉樣品脂肪酸的定 量測定。裂殖壺菌藻粉樣品中的油脂提取后，經皂化、甲酯化后衍生為相應的脂肪酸甲酯， 制備成供試品溶液后，以石英毛細管柱分離，氫火焰離子化檢測器測定，以樣品峰的保留時 間與脂肪酸甲酯標準品的保留時間定性，按內標法計算各脂肪酸的含量，測定結果表明，在 本發明涉及的色譜條件下，37種脂肪酸甲酯在65 min內均獲得較好的分離。
[0007] 在本發明中，內標物選用濃度為10. 0 mg/mL的十三烷酸內標溶液，具有測定結果 重現性好、可信度高等良好的使用效果，當然，為提高內標物的使用效果，在所述的步驟A 中，所述鹽酸的濃度為4 mol/L，所述裂殖壺菌藻粉樣品、內標物、鹽酸的質量比為（0. 2~ 0.8) :(4 ~6) :(4 ~6)〇
[0008] 在所述的步驟A中，油脂的提取包括： A. 1 :將裂殖壺菌藻粉樣品、內標物、鹽酸的混合物依次進行恒溫振蕩、沸水浴加熱和速 冷降溫后，制得樣品溶液，鹽酸濃度為4mol/mL，通常使用漩渦混勻Imin后，再送至水槽進 行恒溫振蕩； A. 2 :在步驟A. 1制得的樣品溶液中加入體積比為1:1的二氯甲燒一甲醇混合溶劑，混 合均勻后進行離心操作，取氯仿層備用； A. 2 :在步驟A. 2制得的氯仿層加入等體積的0. 1%氯化鈉溶液，混合均勻后進行離心操 作，取氯仿層，移至干燥瓶中旋轉蒸發，蒸發后得到油脂。
[0009] 在所述的步驟A. 1中，恒溫振蕩時，溫度控制在50~70°C，振蕩30~50min，振蕩 頻率80~120次/min ;沸水浴的加熱時間為4~6min ;使用-10~-30°C的溫度進行速冷 降溫。
[0010] 所述離心操作的時間控制在8~12次/min，轉速控制在4000~6000r/min。
[0011] 在所述的步驟B中，脂肪酸甲酯溶液的制備包括： B. 1 :皂化，在步驟A提取的油脂中加入0. 5 mol/L的氫氧化鉀一甲醇，充N2，水浴加熱 并回流； B. 2 :甲酯化：回流8~12min后，加入13~15%的三氟化硼-甲醇，水浴加熱并回流 15~30min后，制得脂肪酸甲酯溶液。
[0012] 皂化反應方式式如下：
甲酯化反應方程式如下：
制得的脂肪酸甲酯溶液為二十二碳六烯酸甲酯，其結構式為：
在所述的步驟B中，異辛烷加入沸騰的脂肪酸甲酯溶液中，停止加熱后，再加入飽和 NaCl溶液，脂肪酸甲酯溶液、異辛烷、飽和NaCl溶液的質量比為（40~60) : (40~60): (15~30)，加入異辛烷的目的是：異辛烷作為弱極性溶劑，經過渦旋混合，待測的二十二碳 六烯酸甲酯（DHA)全部從KOH-三氟化硼-甲醇混合溶液中轉移到異辛烷中；加入飽和NaCl 溶液目的是：為了使異辛烷溶液與KOH-三氟化硼-甲醇-水混合溶液完全分層，在實現上 述過程時，脂肪酸甲酯溶液、異辛烷、飽和NaCl溶液的使用量應按照上述質量比范圍嚴格 操作，才能保證操作過程的順利進行。
[0013] 在所述的步驟C中，氣相色譜儀的測定條件中，色譜柱的初始溫度為60 °C，以4 °C/ min升至160 °C后，再以2 °C/ min升至240 °C，其目的是：通過程序升溫，保證裂殖 壺菌藻粉脂肪酸分離度完全滿足定量測定需要。
[0014] 進一步的，所述氣相色譜儀的測定條件中： 色譜柱為 Supelco SP?-2560 石英毛細管柱，100 mXO. 25 mm i.d. X0. 20 μπι; 檢測器為氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度為260°C ; 汽化室溫度：250 °C ; 氣體流量：載氣為高純氮，流速1.0 mL/min，空氣流速350mL/min，氫氣流速35mL/min ; 柱流速：1. O mL/min ; 尾吹流速：40 mL/min ; 分流比：1〇 :1。
[0015] 本發明與現有技術相比，具有以下優點及有益效果： (1)本發明是以十三烷酸為內標物，采用氣相色譜定量測定裂殖壺菌藻粉中的脂肪酸 (DHA)的檢測方法，測定結果以樣品峰的保留時間與脂肪酸甲酯標準品的保留時間定性，并 按內標法計算各脂肪酸的含量，具有樣品處理簡單，操作簡便、快速的特性，測定結果重現 性好、可行度高，并為裂殖壺菌藻粉DHA的質量控制提供了檢測方法依據。
[0016] (2)本發明選擇十三烷酸作為內標物，十三烷酸（CH3(CH2)11C02H，分子量214. 34 )是一種直鏈脂肪酸，其結構與裂殖壺菌藻粉中C16:0、C22:6 (DHA)相似，且在所選定的 色譜條件下，十三烷酸與C16:0、C22:6得到完全分離，且商品化的十三烷酸純度可達98% 以上；另一方面，在裂殖壺菌藻粉油脂提取過程就加入十三烷酸作為內標，可保證內標物與 DHA完成同樣的前處理過程，即酸熱法提取-皂化-甲酯化，從而保證DHA測定結果的準確 性。
[0017] (3)本發明使用酸熱法對裂殖壺菌藻粉中的油脂進行提取，利用鹽酸的加入，保證 了裂殖壺菌藻粉樣品溶液在水浴中振蕩后，使原來結構緊密的細胞壁變得疏松，再經沸水 浴及速凍降溫處理后，使細胞壁進一步的被破壞，有利于細胞壁中糖、蛋白質、油脂等成分 的析出，再用極性較強的三氯甲烷-甲醇混合溶劑進一步有效地浸提出裂殖壺菌藻粉細胞 中的油脂，操作簡單、快速。