一種檢測糖化血紅蛋白的試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及糖化血紅蛋白檢測技術領域，具體涉及一種檢測糖化血紅蛋白的試劑 盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 糖尿病是一組病因和發病機制尚未完全明了的內分泌代謝疾病，目前發病率僅次 于心血管疾病和腫瘤。最近幾年糖尿病的發病率呈不斷上升趨勢，是嚴重威脅人類健康 的世界性公共衛生問題。傳統的糖尿病診斷和治療監測采用空腹血糖、餐后血糖和口服 葡萄糖耐量試驗等，但是血糖參數僅代表抽血時的瞬間血糖水平。近車來，糖化血紅蛋白 (HbAlC)的檢測日益受到臨床的高度重視。糖化血紅蛋白（HbAlC)是指血液中和葡萄糖結 合了的那一部分血紅蛋白。血紅蛋白0亞基N端的纈氨酸的氨基與葡萄糖的自由醛基可 逆縮合為醛亞胺(席夫堿)，而后醛亞胺發生Amadori重排反應，形成較為穩定的N末端果糖 基結構及順式二醇結構單元。當血液中葡萄糖濃度較高時，人體所形成的糖化血紅蛋白含 量也會較高。人體內紅細胞的壽命一般為120天，在紅細胞死亡之前，血液中糖化血紅蛋白 (HbAlC)含量也保持相對不變。糖化血紅蛋白（HbAlC)水平反應了檢測前120天內的平均 血糖水平，而與取血時間、病人是否空腹及是否使用胰島素等因素無關，因此，糖化血紅蛋 白（HbAlC)是反應長期血糖水平的金標準，也是糖尿病輔助診斷、監測、治療的重要指標。
[0003] 糖化血紅蛋白（HbAlC)的測定方法多種多樣，總體來說可分為兩大類：一類是基 于HbAlC和Hb的電荷不同，如離子交換層析法、電泳法；另一類是基于Hb上糖化基團的結 構特點，如親和層析法、免疫法和酶法等。
[0004] 多個研宄表明原理和方法學上的差異決定了檢測試劑性能的優劣，而糖尿病患者 治療目標要求測定值不受測定方法的影響，因此在實驗室里應用不同GHb測定方法所產生 的結果可比性非常重要。
[0005] 離子交換層析法：主要有高效液相色譜法（HPLC)和手工微柱法。此方法是基于血 紅蛋白0鏈N末端纈氨酸糖化后所帶電荷不同而建立。但由于此方法所使用的儀器昂貴， 難以在比較基層的醫院和實驗室普及；微柱法手工操作步驟繁瑣，層析時間和微柱的質量 不易控制，易產生操作技術誤差，重復性欠佳；而且干擾因素很多，尤其對pH值和溫度的變 化敏感，HbF及變異血紅蛋白（HbS、HbC、HbE等）對結果干擾，干擾程度根據柱的分離能力而 定，所以一定要仔細觀察圖譜。
[0006] 電泳法：以瓊脂凝膠電泳為例，Hb于酸性緩沖液條件下（pH6. 0)在瓊脂糖凝膠上 的電泳迀移取決于Hb在凝膠上的吸附情況及其所帶的電荷。該方法標本用量少，分辨率 高，重復性好，有研宄發現血糖值與HbAlc值有顯著相關性，且結果不受溫度及胎兒血紅蛋 白的影響。另外，因為它可測定的Hb線性范圍較寬（13.0~39.0g/L)，可發現異常Hb。該 方法的缺點是每次測定均需成批進行樣本分析，速度比較慢，無法進行實時個體檢測，自動 化程度較差，所測結果與技術人員掃描和對電泳的波峰判斷有關，受主觀因素影響，并且費 用昂貴，因此并不適合臨床實驗室常規使用。
[0007] 親和層析法：硼酸具有與整合在Hb分子上葡萄糖的順位二醇基作可逆結合反應 的性質。通常使用的是間-氨基苯硼酸瓊脂糖，將血樣本加到層析柱后，所有的GHb與硼酸 結合留在柱中，非GHb直接流出層析柱；再加入高濃度也包含順位二醇基的多羥基復合物 (如山梨醇)，GHb與硼酸的結合被替換而被洗脫下來，分別測量兩組分，并計算比值。親和層 析法對變異血紅蛋白和病理血紅蛋白的影響相對其他方法不敏感，但測定的是HbAl即GHb 總量。另外，金標法和硼酸親和層析法密切相關，操作均簡便易行、快速準確、試劑穩定。據 報道，該法不受除Hbs和Hbc之外的任何血紅蛋白變異體和降解產物的干擾，結果可靠，比 較適用于臨床隨時檢測。
[0008] 免疫比濁法：利用抗原、抗體反應的原理進行測定。GHb的e鏈N末端提供了一個 容易被抗體識別的抗原表位，可以用單克隆抗體或多克隆抗體，特異識別GHb的0鏈N末 端最后4~6個氨基酸組成的抗原表位，結合比色或比濁法，以GHb為標準，測定HbAlc的 含量，再測定Hb的含量，最后計算出HbAlc占總Hb的百分含量。此類方法只能作為判斷糖 尿病血糖水平的指標，不可用于變異血紅蛋白的研宄。與其相比，免疫比濁法檢測的方法更 為簡單，不需要額外添加儀器，為臨床提供了一種快速、準確、可靠、簡便的常規方法，在臨 床應用中有著更為廣闊的前景。
[0009] 酶法：全血經溶血處理后，用特異蛋白內切酶將Hb酶解消化成果糖氨基酸，再經 果糖氨基酸氧化酶作用下產生過氧化氫（hydrogen peroxide，H202)，H202的濃度與血液中 GHb的含量成正比，H202在過氧化物酶的作用下與相應的色原耦聯，從而根據顏色變化程 度可得H202濃度，進而得知樣本中GHb的含量；同時測定同一管消化液的總Hb濃度，計算 GHb和Hb的濃度比值，即為GHb結果。此法提供了一個像臨床生化反應一樣快速均一的反 應系統(如葡萄糖、谷氨酸氨基轉移酶)，有很好的精密度，可同時檢測GHb和Hb，且與常規 HPLC法和免疫測定法有很好的相關性。
[0010] 離子捕獲法：應用抗原抗體反應原理，并聯以熒光標志物，通過連接帶負電的多 陰離子復合物，吸附到帶正電的的纖維表面，經過一系列徹底清洗等步驟后，測定熒光強度 變化率，計算GHb濃度。其檢測系統易于規范和重復，可減少操作技術誤差，檢測的敏感 度和特異度高，批內、批間變異系數小。有文獻報道此法影響因素少，準確度高，回收率達 98. 85%，交叉污染率〈0. 01%。該方法是近幾年發展起來的新方法，采用自動分析儀，適用于 批量標本的檢測。
[0011] 綜上所述的幾種方法，要么試劑、儀器成本高，要么操作復雜、要么準確度低，穩定 性差，且均不適合社區及基層醫院。因此，需要對現有的測定糖化血紅蛋白比例的方法進行 改進，提出一種新方法來解決這些問題。
【發明內容】
[0012] 為了克服現有技術中存在的缺點和不足，本發明的目的在于提供一種檢測糖化血 紅蛋白的試劑盒，該試劑盒只需要微量的全血活末梢血樣本，即可在2-3分鐘內實現定量 檢測糖化血紅蛋白的含量，極大提高了篩查的速度，具有靈敏度高、特異性好和操作簡便的 優點；制備方法簡單，易于大規模生產。
[0013] 本發明的另一目的在于提供一種檢測糖化血紅蛋白的檢測方法，該檢測方法只需 要微量的全血活末梢血樣本，即可在2-3分鐘內實現定量檢測糖化血紅蛋白的含量，極大 提高了篩查的速度，具有靈敏度高、特異性好和操作簡便的優點。
[0014] 本發明的目的通過下述技術方案實現：一種檢測糖化血紅蛋白的試劑盒，所述試 劑盒包括： 第一試劑，該第一試劑包括用于裂解紅細胞、釋放糖化血紅蛋白、沉淀總血紅蛋白的硼 酸鹽衍生物； 第二試劑，該第二試劑包括用于洗去未結合糖化血紅蛋白的硼酸鹽衍生物的緩沖液； 以及層析器，該層析器包括用于保留血紅蛋白沉淀的反應膜。
[0015] 優選的，所述試劑盒還包括棕色離心管、試劑瓶和鋁箔袋，棕色離心管裝有第一試 劑，且棕色離心管裝在鋁箔袋內，試劑瓶裝有第二試劑。
[0016] 更為優選的，所述試劑盒還包括包裝盒、內襯和毛細采血管，內襯設置于包裝盒 內，毛細采血管設置于內襯上。層析器還包括塑料外殼，反應膜固定于塑料外殼的內部中 間，塑料外殼與反應膜組裝成層析器，反應膜的孔徑為0. 5 ym。
[0017] 第一試劑為硼酸鹽衍生物，PH8.0,總量200 yL，置于lmL容量的棕色離心管中；第 二試劑為緩沖液，PH8. 0,總量2mL，置于5mL容量塑料試劑瓶中。
[0018] 本發明的試劑盒只需要微量的全血活末梢血樣本，即可在2-3分鐘內實現定量檢 測糖化血紅蛋白的含量，極大提高了篩查的速度，具有靈敏度高、特異性好和操作簡便的優 點；制備方法簡單，易于大規模生產。
[0019] 優選的，每升所述第一試劑包括如下組分： 硼酸鹽衍生物 0. 4-0. 6g 氯化鎂 1. 9-2. 9g 氯化鉀 22-26g 氯化鋇 6. 2-8. 2g 甘氨酰胺鹽酸鹽 6. 6-8. 6g 甲酰胺 25-35g 疊氮化鉀 8-12g 壬基酚聚氧乙烯醚 15-25g 水 余量。
[0020] 優選的，所述硼酸鹽衍生物的結構式為：
其中，Ri為吖嗪基，R2為碳原子數為1-6的烷基。
[0021] 優選的，每升所述第二試劑包括如下組分： 4-羥乙基哌嗪乙磺酸 23_33g 疊氮化鉀 4-6g 氯化鈉 0? 4-0. 8g 甲酰胺 8-12g 聚乙二醇辛基苯基醚 4-6g 水 余量。
[0022] 本發明的另一目的通過下述技術方案實現：一種用于非治療目的使用上述所述的 試劑盒檢測糖化血紅蛋白的檢測方法，包括如下步驟： A、 用毛細采血管吸取5 yL血液樣本，加入裝有200 yL第一試劑的棕色離心管中，上下 顛倒8-12次，充分混勻，于室溫下靜置l-3min，得到反應液； B、 用移液器吸取25 y L上述反應液滴加在層析器中間的反應膜上； C、 8-12s后，取25 y L第二試劑滴加在層析器中間的反應膜上； D、 8-12s后，將層析器