一種疏血通注射液中多肽(寡肽)類成分質量控制的新方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于中藥分析領域，涉及一種中藥制劑的質量控制方法，具體來說，就是采 用一種液相色譜（HPLC)分離，質譜（MS)檢測，結合多反應監測（MRM)，建立疏血通注射液 的LC-MS-MRM分離、檢測、統計鑒定相結合的質量控制模型，并用此模型進行疏血通注射液 中多肽（寡肽）類成分的質量控制。
【背景技術】
[0002] 傳統中藥及其制劑化學成分多樣和復雜，正是其物質基礎的多樣性和復雜性，共 同解釋了中醫藥的整體治療理念和多靶點作用的物質基礎，近年來，中藥物質基礎研宄如 火如荼的進行，但在少量、微量和痕量物質研宄方面存在突破的瓶頸，通常情況下，這些物 質在中醫藥預防和治療疾病中扮演非常重要的角色，如何確定中藥及其制劑中這些少量、 微量和痕量物質，并將這些物質采用簡單、易行和科學的方法進行質量控制，是中醫藥從業 人員需要攻克的一個難題。
[0003] 疏血通注射液是友搏藥業自主研發的國家中藥二類新藥，由水蛭、地龍提取并精 制而成，為國內第一個動物復方水針劑型品種，具有活血化瘀、通經活絡之功效，主要用于 瘀血阻絡所致的腦梗塞急性期，能有效的改善因腦缺血所引發的口眼歪斜、半身不遂、語言 謇澀等癥狀。疏血通注射液大類成分主要含有內源性小分子堿基類、游離氨基酸、游離單 糖、小分子多肽（寡肽）、寡糖或糖肽等多個大類成分，通常認為疏血通中的小分子多肽（寡 肽）可能是疏血通起效的活性組分，但由于含量甚微，采用HPLC直接進樣及常規檢測器 分析，很難獲得良好的信號響應，目前現行疏血通注射液國家藥品標準對于其中多肽類組 分的分析采用的是常規的柱前氨基酸衍生化HPLC分析法間接測定，主要是通過測定樣品 水解后總的氨基酸含量扣除樣品中的游離氨基酸含量，折算其中的多肽類組分含量，試驗 過程復雜，操作繁瑣，若操作不當，可能存在干擾及專屬性不強的問題，且對其真實的多肽 (寡肽）類組分表征性不強。
[0004] MS-MRM(multiplereactionmonitoring)技術是基于已知信息或假定信息設定 質譜檢測規則，對符合規則的離子進行信號記錄，去除大量不符合規則離子信號的干擾，從 而得到質譜信息的一種數據獲取方式。具體地說，即是根據多肽母離子質量數和碎片離子 質量數，選擇母離子-子離子對，允許符合設定的母離子進入碰撞室，碰撞完成后，只記錄 設定子離子信號，通過母離子和子離子的兩次選擇，去除干擾離子，降低化學背景，提高靈 敏度，MS-MRM分析能夠獲得具有足夠統計學意義的定量數據，針對選定的母離子-離子對， 質譜儀可以調整相應的肽段碎裂能量，有效提高碎片離子的質譜響應信號，提高肽段檢測 的靈敏度，并可以實現在一次質譜進樣分析中達到對幾百乃至上千個目標肽段的分析，提 高檢測效率，利用MS-MRM技術特異性，對符合設定的多肽進行檢測，并且進一步進行增強 產物掃描分析，得到高分辨的串聯質譜（MS/MS)碎片數據，使分析過程中的定性結果假陽 性率大大降低。基于前述技術手段，本發明擬選擇合適的樣品前處理方法，比如借助于分子 篩柱層析實現疏血通注射液的脫鹽，并可實現對感興趣的多肽（寡肽）類組分的富集，再通 過HPLC對其中的多肽（寡肽）類組分進一步分離，借助MRM技術，通過MS檢測器對符合設 定規則的靶標肽段母離子與子離子進行掃描分析，去除了干擾離子，降低化學背景，提高了 分析靈敏度，從而建立了一種疏血通注射液中多肽（寡肽）類組分的鑒定手段，可以快速對 疏血通注射液中的相關多肽（寡肽）類組分進行鑒定分析，從而進一步實現對疏血通注射 液中的多肽（寡肽）類組分的定性及質量控制。
【發明內容】
[0005] 1、發明目的
[0006] 本發明的目的在于提供一種液相色譜（HPLC)分離，質譜（MS)檢測，結合多反應監 測（MRM)，建立疏血通注射液的LC-MS-MRM分離、檢測、統計鑒定相結合的質量控制模型，并 用此模型進行疏血通注射液中多肽（寡肽）類成分的質量控制。
[0007] 2、本發明的具體技術方案
[0008] 疏血通注射液中多肽（寡肽）類成分的的檢測方法，包括如下步驟：
[0009] (1)將疏血通注射液供試品溶液進行脫鹽處理
[0010] 脫鹽可采用柱層析或透析處理，優選分子篩柱層析或離子交換柱層析脫鹽處理， 更進一步優選分子篩柱層析脫鹽處理。分子篩柱層析填料可以是葡聚糖凝膠（sephadexG 或者sephacrylS)系列，也可以是聚丙烯酰胺凝膠（BIO-GelP)系列，或者是瓊脂糖凝膠 (Sepharose)系列，優選葡聚糖凝膠系列sephadexG10、sephadexG15 或sephadexG25,更 進一步優選sephadexG15或sephadexG25填料，洗脫劑優選水。
[0011] ⑵HPLC分離
[0012] 將收集的脫鹽樣品溶液高速離心或過0.2ym濾膜后，進行HPLC分離。可以采用普 通液相色譜條件分離，也可以進行納升液相色譜條件分析，還可采用超高效液相色譜條件 分析。更進一步優化普通液相色譜條件：色譜柱采用C18為固定相，流動相A為0. 1 %甲酸 水溶液，流動相B為乙腈或0. 1 %甲酸乙腈溶液，流速及梯度條件根據所用的色譜柱可適當 調整。當選擇納升液相色譜時，優選流速為0. 4y1/min，優選梯度洗脫條件：0~6min，B 為 5%- 8% ;6 ~40min，B為 8%- 30% ;40 ~45min，B為 30%- 60% ;45 ~48min，B為 60%- 80% ;48 ~56min，B為 80% ;56 ~58min，B為 80%- 5% ;58 ~65min，B為 5%。 當選擇UHPLC所用色譜柱時，流速優選0. 1~0. 3ml/min，梯度洗脫條件優選為：0~2min， B為 5%- 8% ;2 ~13min，B為 8%- 30% ;13 ~15min，B為 30%- 60% ;15 ~16min， B為 60%- 80% ;16 ~18min，B為 80% ;18 ~19min，B為 80%- 5% ;19 ~22min，B為
[0013] ⑶MS分析
[0014] 通過HPLC分離的肽類組分，依次進入質譜檢測器分析。其優化的質譜條件為：電 噴霧離子源（ESI)，霧化氣體和干燥氣體為氮氣。更進一步確定為采集正離子模式；一級掃 描范圍：350-2000Da;-級掃描分辨率：70000 ;二級掃描范圍：依賴于一級母離子質荷比自 動選擇；二級碰撞能量（NCEs) :28% ;二級掃描分辨率：17500 ;毛細管溫度：360°C;離子源 電壓：1800V;碎裂模式：HCD。
[0015] ⑷MRM監測
[0016] 根據靶標肽段的質譜信息進行定性分析。通過選擇多個特定靶標肽段組分，進一 步優選組成確定分子量在256-2560道爾頓之間的多肽（寡肽）類成分，更進一步優化組成 確定分子量在1000-2000道爾頓之間的多肽（寡肽）類成分，進行選擇肽段的母離子與特 定子離子的監測，母離子與特定子離子均應與數據庫具有較好的匹配與信號響應則認為鑒 定成功。
[0017] 3、本發明的有益效果
[0018] 采用該方法有利于對疏血通注射液質量控制，更進一步保證產品安全。現行疏血 通注射液質量標準中關于多肽的測定，是基于水解后總氨基酸扣除樣品本身游離氨氨基 酸，得多肽類組分的含量，水解階段需要高溫密封，且水解時間很長，通常需要24h，不管是 游離氨基酸還是總氨基酸的測定都需要柱前衍生化，操作繁瑣且不穩定，對多肽組分的表 征也不夠確定。而用本發明所提供的分析方法，能快速有效地對疏血通注射液中的已知活 性多