煙草蛋白質含量的測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種蛋白質的測定方法，特別涉及煙草中的蛋白質含量的測定方法。
【背景技術】
[0002] 煙草是我國重要的經濟作物之一，在我國國民經濟中占有舉足輕重的地位。蛋白 質是煙葉的主要成分物質之一。過多的蛋白質會增加煙葉燃吸時的苦味和燒焦羽毛味，但 是蛋白質含量過低，產生的煙氣就會顯得平淡，口感和香味也會變差，因此準確的測定煙草 中的蛋白質含量對評價煙葉的質量有重要的意義。目前煙草行業主要采用克達爾法（參見 《中華人民共和國煙草行業標準》YC/T33-1996)評價煙葉的質量。克達爾法的原理是有機 含氮物質中的氮，在濃硫酸及催化劑作用下，經加熱消化分解，氮被分解為氨，與溶液中過 量的硫酸結合成硫酸銨，保留于溶液中。向消化液中加入強堿，釋放出氨，將氨蒸餾于標準 酸液中，用堿標準滴定溶液返滴定，求出試樣的含氮量。近年來，國內煙草檢測部門引進了 煙草化學自動分析儀，在克達爾法的基礎上進行了改進，將克達爾法中蛋白質的前處理方 法與連續流動分析測定煙草總氮的方法相結合（例如：《煙草科技/煙草化學》2004年第1 期，P19)。雖然這些方法有測定準確的優點，但由于操作繁瑣，測定周期長如克達爾法和連 續流動分析法測定周期都大于3h，成本高，不能快速大批量的測定，因此限制了它的應用。
【發明內容】
[0003] 針對現有技術中煙草蛋白質含量測定的缺陷，本發明提供一種煙草蛋白質含量的 測定方法，該方法能快速、準確測定煙草中蛋白質含量，并且操作簡單，成本低。
[0004] 本發明的技術方案是：
[0005] 煙草蛋白質含量的測定方法，有以下步驟：
[0006] 1)取待測干煙葉粉末，加入濃度為0. 05mol/L，pH= 7的磷酸緩沖液研磨，至勾無 明顯的絲狀或塊狀物，得到的勻漿液，4°C下離心分離，取上清過濾；
[0007] 2)步驟1)離心分離得到的殘渣采用同步驟1)的方法研磨、離心、過濾，加入磷酸 緩沖液，所得沉淀充分溶解、離心、過濾；兩次濾液合并，用磷酸緩沖液定容，混勻，得到煙葉 樣品液；
[0008] 3)取步驟2)所述的煙葉樣品液，加入煙葉樣品液的3倍體積的磷酸緩沖液，混 勻，標記為1號待測液；另取步驟2)所述的煙葉樣品液，加入3倍體積的15%三氯乙酸，震 蕩30S，37°C恒溫水浴lOmin，再于20-25°C下離心分離，將離心后的上清液標記為2號待測 液；
[0009] 4)制備工作液
[0010] 5)測定工作液和待測液在562nm處的吸光度值；
[0011] 6)采用步驟5)的方法用已知的不同濃度牛血清白蛋白，測定相應的吸光度得到 標準回歸方程；在562nm處測定1號待測液的吸光度值，在562nm處測定2號待測液的吸光 度值，計算1號待測液中與BCA工作液發生顯色反應的總物質量，減去2號待測液中與BCA 工作液發生反應的干擾物質量，所得的差值即為1號待測液中蛋白質的量，計算待測煙葉 樣品中總蛋白的含量。
[0012] 步驟2)所述的離心分離的轉速為4800r/min，離心時間5min。
[0013] 步驟3)所述的離心分離的轉速為10000r/min，離心lOmin。
[0014] 步驟4)所述的每100體積份A液中BCA二鈉為1重量份，Na2C03S2重量份，酒 石酸鈉為〇. 16重量份，NaOH為0. 4重量份，NaHC03S0. 95重量份。
[0015] 步驟4)所述的工作液的配制方法如下，A液的配置：取BCA二鈉、Na2C03、酒石酸 鈉、Na0H、NaHC03，充分溶解后，用6mol/LNaOH溶液調整溶液為pH為11. 25,定容；B液的配 置：配置4%的硫酸銅溶液；將A，B液按體積比為50 :2混合得BCA工作液；
[0016] 步驟5)所述的測定吸光度值時，先將待測液震蕩30秒，37°C恒溫水浴30min，快速 冷卻至室溫，再進行測定。
[0017] 步驟6)所述的BCA工作液的總的物質量是蛋白質+干擾物質。
[0018] 步驟6)所述的計算待測煙葉樣品中總蛋白的含量，用下列公式：
[0020] 式中，X-樣品中蛋白的百分含量（％ )，V-樣品定容后的總體積（ml)，1號 待測液中與BCA反應總物質的濃度（ug/ml)，(：2-2號待測液中與BCA反應的干擾物質的濃 度（ug/ml)，4一稀釋倍數。
[0021] 步驟6)所述的計算待測煙葉樣品中總蛋白的含量，用下列公式：
[0022] 干重煙葉蛋白含量（％ )=蛋白含量百分數（％ )+G
[0023] 式中：G- 1克被測煙葉烘烤至恒重的質量。
[0024] 本發明的有益效果為：
[0025] (1)克達爾法在對樣品進行前處理時需要根據煙葉中的蛋白質的等電點加入不同 pH值的提取液，使蛋白質發生變性、沉淀。由于煙葉中所含蛋白質的種類很多，不同的蛋白 質有不同的等電點，因此提取液的選擇繁瑣，并且對測定結果的影響很大。本發明的檢測方 法對煙葉樣品的前處理的提取試劑沒有特殊要求，用磷酸緩沖液作為提取液即可，簡化了 提取條件。
[0026] (2)本發明的待測樣品處理過程不需要高溫加熱，并且不使用強酸（濃硫酸）強堿 (氫氧化鈉），具有操作簡單，使用安全，處理時間短的優點。
[0027] (3)本發明采用酶標儀檢測，一次能測定多個樣品，能對煙葉樣品進行批量測定。
[0028] (4)本發明整個測定全過程時間只需要lh左右，極大的改善了目前國內煙葉蛋白 測定方法的測定周期長的缺點。
[0029] (5)本發明將待測液中蛋白質濃度的控制在20_500ug/ml，提高了檢測的精確度 (RSD%〈2% )，并且還具有高靈敏度。
[0030] 本發明所述體積份為毫升時，其重量份為克；體積份為升時，其重量份為千克。
[0031] 本發明所述碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、碳酸氫鈉、硫酸銅、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、牛 血清蛋白均采用市售的分析純產品。
[0032]下面結合【具體實施方式】對本發明作進一步的詳細描述，但不應將此理解為本發明 上述主題的范圍僅限于下述實施例。
【附圖說明】
[0033] 圖1為用牛血清蛋白的濃度和吸光度繪制的標準工作曲線。
【具體實施方式】
[0034] - .材料和儀器
[0035] 1 ?試劑
[0036] 本實施例BCA二鈉（2, 2' -聯喹啉-4, 4' -二甲酸二鈉）（生工生物工程（上海） 股份有限公司）；碳酸鈉（AR);酒石酸鉀鈉（AR);碳酸氫鈉（AR);硫酸銅（AR);磷酸二氫鈉 (AR);磷酸氫二鈉（AR);牛血清蛋白（AR)(以上試劑廠家均是成都市科龍化工試劑廠）；
[0037] 煙葉樣品為重慶市武隆縣生產的成品煙葉云煙97。
[0038] 2?儀器
[0039] 酶標儀（美國寶特Bio-Tek) ;TGL-16M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機 儀器有限公司）；ACCULAB型精密電子天平（精度O.OOOlg，北京賽多利斯儀器系統有限公 司）；KD-98-l型電熱恒溫水浴鍋（金壇市精達儀器制造有限公司）；SHZ-D9型循環水式真 空泵（鞏義市子華儀器有限公司）；梅特勒一托利多實驗室PH計（FE20) ;85-1數顯恒溫磁 力攪拌器（金壇市精達儀器制造有限公司）；MP2002型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器 有限公司）；XK-96A快速混勻器（江蘇新康醫療器械有限公司）。
[0040] 二?實施例
[0041] 實施例1
[0042] (1)待測液制備
[0043] 準確稱取0. 5g干煙葉粉末樣品于玻璃勻漿器中，用液料比（40ml/g)0. 05mol/L pH= 7的磷酸緩沖液充分研磨，直至勻漿器壁上無看到任何明顯的絲狀或塊狀物，將上述 勾衆液裝于l〇ml離心管中，之后用5ml相同的磷酸緩沖液洗勾衆器二次，然后4800r/min， 4°C離心5min。上清液用中速濾紙過濾，殘渣在相同條件下重復以上研磨、離心、過濾操作 1次。最后加入磷酸緩沖液，將第二次離心后沉淀充分溶解、離心、過濾。合并濾液，轉入至 250mL容量瓶中，用磷酸緩沖液定容至刻度線，混合均勻。取定容后的煙葉樣品液2ml，加入 3倍體積的磷酸緩沖液混勻，標為1號待測液。另取容后的煙葉樣品液2mL，加入3倍體積 的15%三氯乙酸，渦旋震蕩305，在37°〇|'亙溫水浴101^11，1000017^11離心10111111，將上清 液標為2號待測液；