一步均相化學發光法進行小分子檢測的方法及所用微粒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用于小分子檢測的一步法均相化學發光方法及所用微粒（包括 受體微粒和供體微粒）。
【背景技術】
[0002] 現代牧業的規模化和集成化生產日趨成熟，為保證畜禽快速健康地生長，越來越 多的獸藥用于實際養殖中，但不合理的獸藥使用往往造成嚴重的獸藥殘留，對現代人的生 活品質帶來深遠的社會問題。根據WHO組織的規定，獸藥殘留指動物產品的任何可食用部 分所包含的原獸藥及其代謝物和伴生的雜質。據報道，目前獸藥殘留已超過120類之多，而 beta-興奮劑（beta-腎上腺素能受體阻斷劑）就是其中的一大類。
[0003] Beta-興奮劑是一類苯乙醇胺類衍生物，臨床上用來治療哮喘、支氣管痙攣等呼吸 系統疾病，20世紀80年代發現，此類藥物可減少脂肪積累，提高胴體肉脂比，促進骨骼肌生 長，故被國內外很多養殖場用作食品添加劑，但人類食用含該類獸藥超標的肉品后，易出現 食物中毒、心血管疾病、新生兒畸形、提升腫瘤爆發率等病癥，目前常被濫用的有克倫特羅、 萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林這幾種。
[0004] 克倫特羅（CBL)，CAS: 129138-58-5,是一種平喘藥，俗稱"瘦肉精"，是最早被發現 并濫用的beta類興奮劑，CBL脂溶性好，吸收快，但在動物體內半衰期長，易殘留，人食用含 CBL的肉品危害甚大，現已禁止CBL用在動物養殖中。取而代之的是萊克多巴胺和沙丁胺 醇等，它們在動物體內毒副作用小，清除時間短，而且增加瘦肉的效率非常高，一噸飼料中 加入萊克多巴胺不到二十克，就可以讓最后長肉階段的豬增加24%的瘦肉，減少34%的脂 肪。FDA規定萊克多巴胺在豬肉中允許值是50ppb(50微克/公斤），牛肉中不得超過30ppb。 沙丁胺醇、特布他林等卻對人體健康危害過大，目前已在全球禁用。以下是這幾種化合物的 分子結構。
[0006]目前針對該類藥物的檢測方法主要有色譜技術、免疫吸附試驗等。色譜技術包括HPLC、LC/MS、GC/MS、GC/FTIR等，可從動物的組織、毛發中檢測出殘留量，非常高效、敏感、準 確，但設備費用昂貴，樣品處理繁瑣，一次處理的樣本少，無法現場檢測；免疫檢測技術，如 酶聯免疫ELISA技術，利用待檢測的樣品與酶標物結合，產生0D值的變化，定量藥品的殘留 值，一次可以檢測多份樣品。但該技術對于操作步驟多，對專業程度要求高，操作易出現假 陽性結果，造成漏檢誤檢；膠體金免疫層析試紙條是也被用于獸藥殘留檢測，但是由于方法 學的原因，檢測靈敏度不高，穩定性差，容易出現假陽性。應國家食品檢驗部門和實際應用 要求，研制靈敏，快速，準確的獸藥檢測方法，檢測畜禽的可食用組織及飼料中獸藥殘留，特 別是克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等幾種，有著重要意義。
[0007] AlphaScreen(AmplifiedLuminscentProximityHomogeneousAssayScreen)技 術是一種基于微粒與微粒之間靠近的效應用于分析物的均相檢測方法，是由1994年發明 的LOCI(LuminescentOxygenChannelingAssay)這種技術的基礎上演化而來。供體含包 裹有酞菁分子，受特殊波長680nm光激發，每秒可產生6萬個以上單線態氧分子，放大信號， 但單線態氧半衰期僅為4us，在有水介質中衰減快，最遠可傳輸200nm距離，如果受體能通 過一定方式，如抗體免疫吸附、親和素-鏈霉素識別等，接近供體，則受體中的熒光基團可 迅速吸收單線態氧，以上轉換方式產生520-620nm光信號，為檢測器探測到。
[0008] 而Alphalisa則是在AlphaScreen技術的基礎上，與經典的ELISA技術有相似之 處的均相檢測方法，我們稱之為均相化學發光技術。因為這種方法不用洗滌，反應在均相跟 中進行，其過程其實是個化學發光的過程。已廣泛用于藥物篩選，其檢測原理如圖1所示。
[0009]AlphaLISA方法的核心是供體（感光微粒）和受體（發光微粒）這兩種直徑約為 200nm的微粒。在兩種微粒表面與生物分子（抗體或抗原蛋白）相偶聯，每個微粒表面可 以覆蓋成百上千個生物分子，可捕獲待測分子。當微粒受到680nm的激光照射后，供體表 面的光敏劑就會將溶液（AlphaLISA反應液）中的氧氣轉化為單線態氧。單線態氧在溶液 中的傳播距離約為200nm，如果供體和受體之間的距離小于200nm，單線態氧就能擴散至受 體微粒，受體中的光敏化合物就能和單線態氧發生化學反應，其中Eu3+配合物就產生高能 級的發光。相反，如果發光微粒和感光微粒的距離大于200nm，單體氧無法擴散至發光微 粒，就不會有光信號的產生。AlphaLISA均相反應就是基于以上原理，如果包被在兩種微 粒表面的生物分子存在相互作用時，就拉近了兩種微粒之間的距離，產生光信號。通過對 光信號的強度檢測，來判斷實際檢測樣品中有無待測目標物。基于AlphaLISA技術的原 理，分子復合物小于200nm的范圍內都可被檢測到。而其他均相技術，例如時間分辨熒光 (TR-FRET)、熒光偏振（FP)，供體和受體之間的距離只能在為10nm內，僅限于小分子的檢 測。AlphaLISA可以應用于酶活性、受體配體反應、DNA、RNA、蛋白、多肽、碳水化合物等檢測。
[0010] 均相化學發光檢測生物分子，可以不用洗滌，這是它的一大優點。但是，這種方法 也有其不足之處：①靈敏度在檢測生物樣本時往往較低（靈敏度一般僅為lng/ml)。檢測 血液、尿液時，由于樣本的基質效益及樣本中的物質對發光微粒所發出的光有吸收作用，檢 測靈敏度沒有在PBS等反應液中的高；②受體微粒中的物質為噻吩和Eu3+配合物，這些物質 都要包裹在200nm的聚苯乙烯微球中，還要有合適的比例，制備困難；③微粒中的物質多， Eu3+配合物包裹量就少，這影響微粒的發光強度和量子產率，影響了靈敏度；④檢測儀器昂 貴，影響了該方法的推廣。
【發明內容】
[0011] 本發明要解決的技術問題是提供一種新的一步法均相化學發光技術，用于均相、 快速、高靈敏度的獸藥殘留檢測，以及用于飼料中常見的獸藥成分含量測試，如克倫特羅、 萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等。
[0012] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種用于獸藥小分子檢測的微粒，包括受體 微粒和供體微粒：
[0013] 一、受體微粒的制備方法為包括如下步驟：
[0014] ①、將獸藥小分子和載體蛋白偶聯，經PBS透析，得到標記有獸藥小分子的載體蛋 白；所述獸藥小分子與載體蛋白的摩爾比為10~50:1 ;
[0015] ②、按照每0. 05mmol的ATTA_Eu3+配用0. 9~1.lg(較佳為lg)聚苯乙稀微球的 用量比，在ATTA-Eu3+中加入聚苯乙烯微球溶液，超聲包裹；得到含均相化學發光受體微粒 的溶液；
[0016] ③、在均相化學發光受體微粒表面包被標記有獸藥小分子的載體蛋白：
[0017] 將步驟②所得的含均相化學發光受體微粒的溶液進行清洗，得清洗后均相化學發 光受體微粒；
[0018] 取清洗后均相化學發光受體微粒0. 2ml，加入0. 09~0.llmg(較佳為0.lmg)標記 有獸藥小分子的載體蛋白，再加入9~1luL濃度為350~450mM的（較佳為10uL400mM) 氰基硼氫化鈉溶液，室溫旋轉（轉速為30~50rpm，例如為35rpm)反應18~24hrs后終止 反應；所得的反應液經后處理（包括分散、洗滌離心等），得標記有獸藥小分子-載體蛋白 的均相化學發光受體微粒（AlphaLISAAcceptorBeads);
[0019] 二、供體微粒的制備方法為：將醛基化AlphaLISA供體微球與上述獸藥小分子相 對應的抗體相偶聯；包括如下步驟：
[0020] 含有lmg醛基化AlphaLISA供體微球的溶液經離心和分散沉淀的處理后，加入 0. 09~0.llmg(較佳為0.lmg)與上述獸藥小分子相對應的抗體和9~lluL濃度為350~ 450mM的（較佳為10uL400mM)氰基硼氫化鈉溶液，室溫旋轉（轉速為30~50rpm，例如為 35rpm)反應18~24hrs后終止反應；所得的反應液經后處理（包括分散、洗絳離心等），得 帶有獸藥小分子抗體的均相化學發光供體微粒（AlphaLISADonorBeads)。
[0021] 作為本發明的用于獸藥小分子檢測的微粒的改進：
[0022] 所述步驟一的受體微粒的制備方法中：
[0023] 所述步驟②中：
[0024] 所述聚苯乙烯微球的粒徑為175nm;所述超聲包裹為200w超聲5s，停頓5s;如此 重復60次；
[0025] 所述步驟③中：
[0026] 含均相化學發光方法受體微粒的溶液進行清洗的方法為：將10ml含均相化學發 光受體微粒的溶液離心，棄上清液后加入7~9ml(較佳為8ml)重懸液I重懸浮；重復上述 離心和重懸浮2~3次后再離心，得清洗后均相化學發光受體微粒；
[0027] 所述重懸液I為 8ml100mMH印es(pH7. 4)，1. 25uL10%Tween-20 ;
[0028] S卩，重懸液I的制備方法為：在8mllOOmMH印es(pH7.4)溶液（去離子水為溶 劑）中，加入1. 25uL10% (體積濃度）Tween-20溶液（去離子水為溶劑）。
[0029] 所述后處理為：將所得的反應液離心，離心所得沉淀用重