一種檢測抵抗素的試劑盒及其制備方法和檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及免疫分析領域，特別是設及一種檢測抵抗素的試劑盒及其制備方法和 檢測方法。
【背景技術】
[0002] 抵抗素（resisting,RST)是2001年發現的一種白色脂肪細胞特異表達和分泌 的激素蛋白。因它有降低膜島素敏感性的作用，故將其命名為抵抗素，它屬于抵抗素樣分 子家族（resistin-likemolecules,RELMs)分泌型蛋白質家族成員。人類抵抗素是一種 12. 5kDa的蛋白質，其前體含有108個氨基酸，其在人體內細胞中合成后，被分泌到血液中。 抵抗素具有類似炎癥因子的蛋白分子結構，與單核巨瞻細胞的功能有關，能影響多形核白 細胞的趨化運動和氧化爆發，導致患者免疫功能素亂，在免疫炎癥反應中發揮重要作用，此 夕F，有研究顯示，且抵抗素水平與體重指數和內臟脂肪含量正相關，通常情況下通過檢測抵 抗素的水平來檢測脂肪在人體內的沉積情況。
[000引在正常情況下，其在人體血液中的含量很低，一般小于14ng/mU而在消化性潰瘍 急性穿孔患者、潰瘍性結腸炎或肥胖患者血液中抵抗素的水平較高，約為l00-3(K)ng/ml。通 過檢測W急癥腹痛為主訴的患者血清中抵抗素的水平可W實現對消化性潰瘍急性穿孔、潰 瘍性結腸炎及肥胖等疾病的早期診斷和排查，為該類疾病的診斷治療提供數據支撐。
[0004] 目前，檢測抵抗素的方法主要有膠乳增強免疫比濁法、酶聯免疫吸附試驗巧LISA) 等。膠乳增強免疫比濁法存在檢測線性范圍窄、陽性率低等缺點；ELISA法存在靈敏度低、 線性范圍窄、不易實現全自動化等缺陷；從而限制了推廣使用，無法廣泛地應用于臨床診斷 和科研工作。目前化學發光免疫分析技術因其有上述諸多優點得到了廣泛的應用。
【發明內容】
[0005] 發明目的；本發明的第一個目的是提供一種檢測抵抗素的定量檢測試劑盒，具有 簡便、快速、靈敏度高、線性范圍寬和穩定性好等優點，W克服現有技術的不足。
[0006] 本發明的第二個目的是提供了上述檢測抵抗素的試劑盒的制備方法和檢測方法。
[0007] 本發明的第S個目的是提供了檢測抵抗素的試劑盒的檢測方法。
[000引本發明采用化學發光免疫分析技術對人血清中抵抗素的水平進行定量檢測，實現 對消化性潰瘍急性穿孔、潰瘍性結腸炎及肥胖等疾病的早期診斷和排查。
[0009] 技術方案：為了解決上述技術問題，本發明提供了一種檢測抵抗素的試劑盒，所 述試劑盒包括抗異硫氯酸巧光素多克隆抗體包被的磁微粒，異硫氯酸巧光素標記的抵抗素 單克隆抗體，堿性磯酸酶標記的抵抗素單克隆抗體和堿性磯酸酶催化發光的化學發光底物 液。
[0010] 作為優選，所述試劑盒還包括用于稀釋所述抗異硫氯酸巧光素多克隆抗體包被的 磁微粒、異硫氯酸巧光素標記的抵抗素單克隆抗體和堿性磯酸酶標記的抵抗素單克隆抗體 的稀釋液，所述稀釋液為抑值為7. 5~8. 5、含質量比為0. 3~0. 7%的牛血清白蛋白BSA 和0.05~0.3%的疊氮化鋼防腐劑NaN3的0.05~0.2MTris-HCl緩沖液。
[0011] 作為優選，所述抗異硫氯酸巧光素多克隆抗體包被的磁微粒懸浮于稀釋液中，配 制成0. 5~2yg/mL的磁微粒溶液。
[0012] 在實際的免疫檢測中，由于待測樣品中所含的雜質成分較多，一定程度上影響了 檢測靈敏度和準確性，所W從復雜的待測樣品基質中快速分離、純化出目的待測物是臨床 檢驗工作者面臨的難題之一。磁微粒免疫檢測技術是利用高分子材料合成一定粒度大小的 磁性固相微粒作載體，W物理吸附、化學偶聯等方法包被上具有特異性親和力的抗體或抗 原等各種免疫活性物質，具有分離速度快、效率高、可重復性好、操作簡單、不影響被分離細 胞或其他生物材料的生物學性狀和功能等特點，在外加磁場作用下可定向運動，使得某些 特殊成分得W分離、濃集或純化。作為優選，所述磁微粒為0. 7~3ym粒徑、四氧化=鐵內 核、表面包裹有活性基團的聚合物。優選地，所述活性基團為駿基。
[0013] 作為優選，所述異硫氯酸巧光素標記的抵抗素單克隆抗體溶解在稀釋液中，配制 成0. 25~0. 5yg/mL異硫氯酸巧光素標記的抵抗素單克隆抗體溶液。
[0014] 作為優選，所述堿性磯酸酶標記的抵抗素單克隆抗體溶解在稀釋液中，配制成 0. 25~0. 5yg/mL堿性磯酸酶標記的抵抗素單克隆抗體溶液。
[0015] 作為優選，所述化學發光底物液是0. 1~0. 3M，pH值為8~10的Tris-HCl緩沖 液，并含有0. 2~0. 4mg/mL的二氧雜環己燒。
[0016] 更為優選的是，所述化學發光底物液是0. 2M，抑值為9. 3的Tris-HCl緩沖液，并 含有0. 3mg/mL的二氧雜環己燒。
[0017] 作為優選，所述試劑盒還包括清洗液，所述清洗液為0. 1~0. 2M，抑值為8~9的 Tris-HCl緩沖液中加入質量百分比為0. 01~0. 04%的吐溫20和15~20%的氯化鋼。
[0018] 更為優選的是，所述清洗液為0. 1M，抑值為8的Tris-HCl緩沖液中加入質量百 分比為0. 02%的吐溫20和15%的氯化鋼。
[0019] 作為優選，所述試劑盒還包括抵抗素系列校準品，所述校準品濃度范圍為0~ 50ng/mL。
[0020] 作為優選，本發明提供的試劑盒還包括反應試管，其材料選自透明的聚苯己締、聚 己締和聚丙締中的至少一種。
[0021] 本發明提供的試劑盒的檢測原理為；將待測樣本，FITC標記的抵抗素單克隆抗體 溶液和ALP標記的抵抗素單克隆抗體溶液混合溫育，巧光素（FITC)和堿性磯酸酶（AL巧標 記的一對抗抵抗素單克隆抗體與樣本中抵抗素抗原分子結合，形成免疫復合物。然后加入 包被有抗FITC多克隆抗體的磁微粒，免疫復合物被吸附到磁微粒表面。洗漆去除未結合的 抗體和雜質后加入發光底物，ALP催化底物發光，測定相對發光強度（RLU)。在一定范圍內 RLU與抵抗素抗原濃度呈正比，通過內插法就可W從標準曲線上讀取待測樣本的抵抗素含 量。
[0022] 一種檢測抵抗素的試劑盒的檢測方法，包括W下步驟：
[0023] 1)將試劑盒中的試劑從儲存條件下取出后應平衡到室溫再用于檢測；使用前將 抗FITC多克隆抗體包被的磁微粒溶液徹底混勻，確保磁微粒懸浮均勻；用去離子水將清洗 液稀釋，混勻；設定好37°C水浴；使化學發光檢測儀處于待測狀態；根據需要準備試管并做 好標記；
[0024] 2)加校準品和待測樣本至對應試管中，加FITC標記的抵抗素單克隆抗體溶液和 ALP標記的抵抗素單克隆抗體溶液至每一試管中，用多管混勻器振蕩混勻，置37 + 0. 5°C水 浴，然后加入抗FITC多克隆抗體包被的磁微粒溶液至每一試管中，用多管混勻器振蕩混 勻，置37 + 0. 5°C水浴，試管連架放至磁分離器上，確保試管與磁板接觸，沉淀；用一大而緩 慢的圓周運動倒轉分離器倒出上清液，把倒轉的試管連同分離器一起放在濾紙上，拍擊，W 除去沾在管壁上的液滴，加稀釋后的清洗液至每一試管中，置多管混勻器振蕩混勻；重復上 述清洗操作，共清洗3次；
[002引如加堿性磯酸酶催化發光的化學發光底物液至每一試管中，混勻，在5分鐘內用 發光檢測儀進行檢測，利用四參數邏輯擬合得到校準品劑量-反應曲線的回歸方程，再根 據待測樣本的相對發光強度可W從回歸曲線上返算出樣本中待測物的濃度。
[0026] 有益效果；本發明提供的檢測抵抗素的試劑盒采用雙抗體夾屯、法的反應模式，有 效地利用了化學發光檢測技術結合磁微粒免疫分離技術原理，定量測定人體血樣品中的抵 抗素含量，確保了檢測的靈敏度，且各項指標均達到同類進口試劑盒的分析法水平。而且， 對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單可靠，可快速、高通量檢測大批樣品，便于操 作和生產。本發明提供的試劑盒結構簡便，使用方便，靈敏度高，特異性強，檢測范圍寬，操 作簡單，試劑盒成本低，無放射性污染，臨床適用性強，更適用于我國臨床檢測，適合在國內 的各級醫院推廣使用。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發明實施例試劑盒中抵抗素的濃度一發光值曲線圖；
[002引圖2為本發明實施例A，B點連點擬合曲線圖（單位；ng/ml)。
[0029]
【具體實施方式】
[0030] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，W下結合具體實施例，并參照 附圖，對本發明進一步詳細說明。
[0031] 實施例1檢測抵抗素的試劑盒的制備
[0032] 一、抵抗素校準品的制備
[003引用抑=7. 5,0. 1MTris-HCl緩沖液將抵抗素純品稀釋成6個水平的凍干校準品， 用純水復溶后的目標濃度分別為0、0.25、2、10、25和50ng/ml。其中，所述抵抗素校準品的 原料為標準級，純度不低于99 %。
[0034] 二、抗異硫氯酸巧光素（FITC)多克隆抗體包被的磁微粒溶液的制備
[0035] 將粒徑為1ym的磁微粒加磁場，靜置15min，倒出上清液，用抑=4. 7的25mM的 MES緩沖液清洗3次，并用該緩沖液進行懸浮，濃度為50mg/mL;每血懸浮液中加入抗FITC 多克隆抗體2mg，在室溫條件下混合均勻；用去離子水配制濃度為lOmg/mL的l-(3-二甲 氨基丙基）-3-己基碳二亞胺巧DC)溶液，每血磁微粒懸浮液中加入ImL濃度為lOmg/mL 的邸C溶液，在室溫條件下攬拌反應4小時后得到包被抗FITC多克隆抗體的磁微粒；然后 加磁場，靜置15min，倒出上清液，用抑=8. 0,含質量比為0. 5%的牛血清白蛋白炬SA)和 0. 2%的疊氮化鋼防腐劑的0. 1MTris-HCl緩沖液清洗4次，并用該緩沖液將包被抗FITC 多克隆抗體的磁微粒配制成1yg/mL的工作液。該包被抗FITC多克隆抗體的磁微粒溶液 在4°C保存，不應凍存，用時混勻。磁微粒為0. 7ym粒徑、四氧化=鐵內核、表面包裹有活性 基團的聚合物；活性基團為駿基。
[0036]=、異硫氯酸巧光素（FITC)標記的抵抗素單克隆抗體溶液的制備
[0037] 將抵抗素單克隆抗體置于透析袋，在用0. 2MpH=9. 0的碳酸鹽緩沖液中過夜透 析；用0. 2M抑=9. 0的Na肥〇3溶液配制濃度為0. 5mg/mL的FITC溶液，每mg抵抗素單 克隆抗體加入0. 15mL濃度為0. 5mg/mL的FITC溶液，混合均勻，室溫下反應20小時后，在 0. 2MpH=9. 0的碳酸鹽緩沖液中過夜透析，即得到異硫氯酸巧光素標記的抵抗素單克隆 抗體；用含有質量百分含量為0. 5%的牛血清白蛋白和質量百分含量為0. 2%的疊氮化鋼 防腐劑的0. 1M Tris-HCl緩沖液稀釋異硫氯酸巧光素標記的抵抗素單克隆抗體，得到濃度 為0. 5 y g/mL的異硫氯酸巧光素標記的抵抗素單克隆抗體溶液。
[003引四、堿性磯酸酶（AL巧標記的抵抗素單克隆抗