一種ngal快速檢測試劑及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥試劑領域，具體涉及一種NGAL(中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白)快速檢測試劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002]急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是臨床各科室最常見的急危重癥之一。從輕微血肌酐升高到嚴重無尿性AKI，AKI程度和臨床表現不一而足，AKI與患者病死率、慢性腎臟病(CKD)的發生以及維持性透析率密切相關。AKI發病率逐年增高，已由1988年的610例(每百萬人)增加至2009年的2888例(每百萬人)，全國近10年的統計數據顯示，AKI患者占同期住院患者比例為0.28%~3.19%，而在I⑶中更高達30%?50% ;病死率為14.5%~41.9%ο危重癥患者尤其老年患者的AKI發生率日益增加，需要接受腎臟替代治療的AKI死亡率高達50%~80%，全球每年約有200萬人死于AKI。因此，如何防治AKI的發生、發展已成為當前腎臟病研宄工作中的一個重點和熱點。
[0003]目前，我國AKI臨床研宄主要聚焦于AKI流行病學調查、早期分類和診斷、AKI早期生物標記物研宄、特殊類型AKI的診治及AKI連續性血液凈化治療等。要想更好地對AKI進行定義和分期、實現早期診斷，研發更好的腎臟損傷標志物是一個重要研宄方向。在早期診斷方面，目前研宄較多的生物標志物包括腎損傷分子(KIM)-l、中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)、IL-18及半胱氨酸蛋白酶抑制劑C (Cystatin C)等。
[0004]中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin，NGAL)，也稱為脂質運載蛋白-2 (Lipocalin-2)，是1993年在動物中性粒細胞中發現的與明膠酶結合的分明性蛋白，相對分子質量為25000，屬于脂質運載蛋白家族的成員。在生理狀態下，中性粒細胞、腎小管上皮細胞、肺泡巨噬細胞、支氣管上皮黏液細胞、胃壁細胞、小腸潘氏細胞、肝膽管細胞、胰腺細胞等分泌少量NGAL，循環NGAL通過腎小球濾過，在近端腎小管重吸收。研宄人員通過缺血性及腎毒性順上動物模型發現，在損傷發生2h內腎小管上皮細胞NGAL的轉錄表達有顯著升高。大量后續的臨床研宄也證實了動物的結果，血液和尿液NGAL在不同年齡、不同疾病患者中都具有較好的急性腎功能損傷(acute kidneyinjure,AKI)預測價值。發生缺血性和毒性腎損傷的過程中，腎小管上皮細胞中的NGAL將顯著增加，在開始的兩個小時內，尿液和血液中NGAL水平將顯著增加，因此NGAL是早期急性腎損傷的敏感標志物。
[0005]中國專利(CN101163971B)提出通過對體液中人嗜中性粒細胞明膠酶相關性脂籠蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin，NGAL)的測定來診斷并監測人的疾病的方法，包括由缺血性損傷(由于對腎臟的血液供給受損)、接觸腎毒劑或對移植腎臟的排斥所導致的那些。特別可用于早期檢測腎臟對缺血性損傷的反應，缺血性損傷的臨床或病理結果通常是急性腎衰竭(ARF)、急性腎小管壞死(ATN)或急性腎小管間質性腎病(ATIN)，并也可用于監測腎病的病程，包括對治療性措施的反應。
[0006]目前，檢測NGAL方法主要有酶聯免疫法(中國專利CN101650369)、基于抗體免疫的微型柱測試法(中國專利CN101163971)、膠乳免疫比濁法(中國專利CN102072960A)和NGAL熒光免疫層析定量檢測試紙條(中國專利CN202837303U)。酶聯免疫法操作容易受到酶活性變化的影響，結果不太準確；膠乳比濁法反應特異性不好，所需試劑比較復雜。免疫層析方法操作簡便，但其一方面其靈敏性不高；另一方面由于結合墊上標記物釋放不均一、NC膜的差異大、樣品層析速度不可控等原因導致檢測結果精密度不高。
[0007]為解決上述問題，如果能利用NGAL(中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白)標志物的抗體，以微流控技術為平臺，研發出一種針對AKI診斷的NGAL快速檢測試劑。使其與現有檢測試劑相比，具有操作方便、檢測快速、靈敏度高、準確性好等優點；將其應用于腎損傷的監測，可以提高腎損傷診斷的準確率。則就會受到市場的廣泛歡迎和具有極大的市場價值。
【發明內容】
[0008]為了解決現有技術中存在的上述問題，本發明的目的是提供一種NGAL快速檢測試劑及其制備方法，該方法制備的試劑具有操作方便、檢測快速、靈敏度高、準確性好等優點，且試劑制作工藝簡便，制作過程對環境無污染，成本低。
[0009]為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:一種NGAL快速檢測試劑，包括基片和覆蓋在基片上的蓋片，其特征在于，所述基片上依序加工有加樣區、反應區、檢測區和廢液區；所述加樣區、反應區、檢測區和廢液區均由微流通道構成；所述加樣區放置有用于過濾生物樣品的聚酯膜；所述反應區包被有干燥的熒光微球標記抗體，該干燥的熒光微球標記抗體包括焚光微球標記NGAL多克隆抗體和焚光微球標記羊抗鼠IgG (immunoglobulinG，免疫球蛋白G)抗體；所述檢測區包被有檢測線和控制線，所述檢測線包被有NGAL多克隆抗體；所述控制線包被有鼠IgG抗體；所述廢液區為具有毛細作用的微流通道構成。
[0010]一種NGAL快速檢測試劑的制備方法包括以下步驟:
步驟SI，制備熒光微球標記NGAL(中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白)多克隆抗體和熒光微球標記羊抗鼠IgG抗體；
步驟S2，制備出布滿微流通道的基片和蓋片；
步驟S3，在基片上制備出加樣區、反應區、檢測區和廢液區；
步驟S4，NGAL快速檢測試劑的組裝。
[0011]優選的技術方案，所述步驟SI中制備熒光微球標記NGAL多克隆抗體和熒光微球標記羊抗鼠IgG抗體的過程如下:
一、制備焚光微球標記NGAL多克隆抗體
步驟 S01，取 50mM 且 PH 值為 5.0 的 MEST (2- (N-morpholino) ethanesulfonicacid-tween, 2 - (N-嗎啉)乙磺酸-吐溫)，將NGAL多克隆抗體稀釋為體積為100ul，濃度為2mg/ml的抗體溶液；
步驟S02，取10ul的0.02g/100ml的熒光微球，加到步驟SOl制得的抗體溶液中，超聲作用I分鐘；
步驟S03，室溫下，攪拌孵育15分鐘；
步驟S04，加入5ul的0.5g/ml的EDC，超聲作用I分鐘；
步驟S05，加入0.4ul的IM的氫氧化鈉，調節pH為6.5 土 0.2，室溫下攪拌反應3小時；超聲作用I分鐘，再加入20ul的IM的甘氨酸，反應30分鐘；
步驟S06，在20000g的離心力作用下離心10分鐘，棄去上清液并用200ul的PBS(Phosphate Buffered Saline,磷酸鹽緩沖液)重懸，超聲作用I分鐘；
步驟S07，重復步驟S06兩次后，最后將熒光微球用10ul的1%PBSA (含1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液)溶解重懸，即制得熒光微球標記NGAL多克隆抗體；
二、制備熒光微球標記羊抗鼠IgG抗體
步驟S101，取50mM且PH值為5.0的MEST，將羊抗鼠IGG抗體稀釋為體積為lOOul，濃度為2mg/ml的抗體溶液；
步驟S102，取10ul的2%的熒光微球，加到步驟SlOl制得的抗體溶液中，超聲作用I分鐘；
步驟S103，室溫下，攪拌孵育15分鐘；
步驟 S104，加入 5ul 的 0.5g/ml 的 EDC( 1- (3-DimethyIaminopropyI) -3-ethylcarbodiimidea-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺)，超聲作用I分鐘；
步驟S105，加入0.4ul的IM的氫氧化鈉，調節pH為6.5 土 0.2，室溫下攪拌反應3小時；超聲作用I分鐘，再加入20ul的IM的甘氨酸，反應30分鐘；
步驟S106，在20000g的離心力作用下離心10分鐘，棄去上清液并用200ul的PBS重懸，超聲作用I分鐘；
步驟S107，重復步驟S106兩次后，最后將熒光微球用10ul的1%PBSA溶解重懸，即制得熒光微球標記羊抗鼠IGG抗體。
[0012]進一步優選的技術方案，所述步驟S2中制備出布滿微流通道的基片和蓋片如下: 步驟S21，在70攝氏度條件下，恒溫鼓風干燥箱中烘干COC基片；
步驟S22，使用注塑成型法以帶有凸起微通道結構的金屬材料作為陽模，制備出帶微流通道的COC基片和COC蓋片，且該帶微流通道的COC基片注塑成型有預設加樣區、預設反應區、預設檢測區、廢液區；所述預設檢測區帶有預設檢測線位置和預設控制線位置。
更進一步優選方案，步驟S3中反應區的制備過程如下:使用含有1%BSA的0.0lM的PBS, 1000倍稀釋熒光微球標記NGAL多克隆抗體；使用含有1%BSA的0.0lM的PBS，10000倍稀釋熒光微球標記羊抗鼠IGG抗體；將稀釋后的熒光微球標記NGAL多克隆抗體和稀釋后的羊抗鼠IGG抗體混合，得到兩種抗體的混合物；使用噴點儀將1ul所述混合物噴點于帶有微流通道COC基片上預設反應區的中心，再在37°C攝氏度條件下干燥24小時，即制得試劑的反應區。
[0013]再更進一步優選的技術方案，步驟S3中檢測區的制備過程如下:使用噴點儀在帶微流通道的COC基片的預設檢測區的預設檢測線位置滴加2ul含有1%蔗糖的0.0lM的PBS，且抗體濃度為2mg/ml的NGAL多克隆抗體；使用噴點儀在帶微流通道的COC基片的預設檢測區的預設控制線位置滴加2ul含有1%蔗糖的0.0lM的PBS，且抗體濃度為2mg/ml鼠IgG抗體；然后在37°C干燥3小時，即制得帶檢測線和控制線的檢測區。
[0014]步驟S4中NGAL快速檢測試劑的組裝過程為:在COC基片的加樣區加入濾血膜，再將COC蓋片覆蓋在COC基片上，使用焊接的方式將COC基片和COC蓋片封合起來，且所述COC基片和COC蓋片上的微流通道形成閉合的通道，即完成試劑的組裝。
[0015]本發明相對于現有技術的有益效果為:本發明利用優化的針對NGAL (中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白)標志物的抗體，以微流控技術為平臺，開發出針對AKI診斷的NGAL快速檢測試劑。與現有檢測試劑相比，具有操作方便、檢測快速、靈敏度高、準確性好等優點，應用于腎損傷的監測，可以提高腎損傷診斷的準確率。
【具體實施方式】
[0016]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明了，下面結合【具體實施方式】，對本發明進一步詳細