基于暗場成像的固態納米通道的光電同步傳感方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及電化學分析技術及納米光譜技術領域，具體地說，涉及利用等離子共振散射結合離子電流檢測技術實現納米通道光電信號同步傳感的方法。
【背景技術】
[0002]納米通道電化學檢測技術(Nanopore Technique)是一種單分子分析技術，它利用生物分子自組裝或通過半導體微加工手段，獲得孔徑從I納米至數百納米的納米孔，然后利用電場驅動單個分子、納米顆粒、聚合物等待測物穿過納米尺寸的通道，從而引起納米通道產生微弱的信號變化，在單分子、單顆粒水平上研宄待測物組成、運動等性質，實現對單個分子實時、高通量、無標記、超靈敏的分析。納米通道電化學檢測技術的主要應用領域包括:單分子DNA測序、致病蛋白及多肽的檢測、生物分子相互作用過程的研宄以及單個納米顆粒的分析等等。
[0003]固體納米通道技術一般是利用微加工技術在固態薄膜上獲得納米孔，然后通過納米孔連通電化學池及其內部的電解質溶液，在兩個電化學池內施加一定電位后產生從皮安到納安水平的離子電流；當單個待測物通過納米通道時，由于單個待測物體積的排阻效應及自身待定的情況，造成從皮安到納安水平的電流阻斷或信號增強。
[0004]為了實現固體納米通道技術可多通道同步讀取，以及同步獲取待測物分子結構、光學性質等信息，人們研宄出了利用熒光標記進行納米通道光信號讀取的方法，例如，利用過納米孔過程單個待測物發出的微弱熒光信號的改變，對單個分子的行為、結構等進行分析。目前，用于納米通道光電同步讀取的技術是需要引入染料基團的，而這樣做不僅會對單個分子、單個顆粒水平的待測物的運動行為產生影響，而且標記過程繁雜，染料分子光漂白、標記的失敗都會影響單分子的分析結果。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服上述不足，提供一種基于暗場成像的固態納米通道的光電同步傳感方法，通過金屬鍍膜的固態納米通道芯片，利用可見光在納米通道邊緣激發局域表面等離子激元產生有特征的散射信號并被顯微成像及光信號監測系統收集和記錄，從而在不引入染料分子、無需標記的情況下，實現納米通道中光電信號的同步傳感。本發明的傳感方法能對單分子、單顆粒水平實現對多種生物大分子(包括核糖核酸、脫氧核糖核酸、多肽、蛋白)、無機聚合物、金屬或非金屬納米顆粒的運動行為、光學信息、結構性質信息進行實時高速讀取。
[0006]為實現上述目的，本發明采取了以下技術方案。
[0007]一種基于暗場成像的固態納米通道的光電同步傳感方法，其特征在于，包括以下步驟:
(O制備涂敷有金屬納米涂層的半導體基片薄膜
①利用微加工技術，在硅框架上制備厚度為100 nm以下的納米通道半導體基片薄膜； ②在所述半導體基片薄膜上均勻涂敷一層或多層金屬納米涂層，獲得涂敷有金屬納米涂層的半導體基片薄膜；
(2)制備金屬覆膜納米通道芯片
利用半導體納米加工技術，在步驟(I)獲得的涂敷有金屬納米涂層的半導體基片薄膜上加工直徑為納米水平的通道，所述通道的尺寸根據實際待測物選取，獲得金屬覆膜納米通道芯片；
(3)制備光電檢測微池
將步驟(2)獲得的金屬覆膜納米通道芯片固定密封在由兩個池體構成的光電檢測微池之間，使半導體基片薄膜上的納米通道成為上下兩個池體之間唯一的連接通道；在一端的光電檢測微池中加注所需濃度的電解質溶液；
(4)利用金屬覆膜納米通道暗場成像
將步驟(3)封裝好的光電檢測微池放入暗場顯微成像系統進行暗場成像，利用光強和光譜采集記錄裝置持續記錄光散射強度和光譜數據，獲得持續穩定的納米通道特征散射信號對時間的基線數據；
(5)利用金屬覆膜納米通道記錄離子電流強度
在步驟(3)封裝好的光電檢測微池上下兩池體間施加直流電壓，利用皮安級電流放大器和高速數據采集裝置，持續記錄離子電流強度數據，獲得持續穩定的納米通道離子電流信號對時間的基線數據；
(6)加入待測物進行光電同步檢測
在步驟(3)封裝好的光電檢測微池中加入待測物，再在所述光電檢測微池的上下兩池體間施加直流電壓，即用封裝的金屬覆膜納米通道芯片進行暗場成像，記錄光散射強度和光譜數據，再同步記錄納米通道離子電流和特征散射信號隨時間的變化數據；
(7)多通道數據分析
將步驟(6)同步記錄得到的光散射強度和光譜數據與離子電流強度隨時間變化的數據以及納米通道特征散射信號隨時間變化的數據進行分析比對。
[0008]進一步，步驟(I)所述的半導體基片薄膜包括:低應力氮化娃薄膜、二氧化娃薄膜、三氧化二鋁薄膜、硫化鉬薄膜或石墨烯薄膜。
[0009]進一步，步驟(I)所述的金屬納米涂層包括金、銀、銅或鋁的、能產生表面等離子激元(SPP)的金屬納米涂層，所述金屬納米涂層的厚度根據待測物性質選取。
[0010]進一步，步驟(2)所述的納米水平的通道為直徑I微米以下的通孔。
[0011]進一步，步驟(3)所述光電檢測微池為透明的上下兩個池體，所述池體的材質為聚合物、石英、玻璃或者能滿足透光、密封要求且不與待測物發生化學反應的其他材料。
[0012]進一步，步驟(3)所述的電解質溶液為硝酸鉀、氯化鉀、氯化鈉或磷酸鹽緩沖溶液。
[0013]進一步，步驟(6)所述的待測物包括:核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、多肽、蛋白、納米顆粒或病毒。
[0014]進一步，步驟(5)和步驟(6)所述的直流電壓的電壓范圍為-1OOOmV至+1000mV，其產生的離子電流強度為皮安水平到納安水平。
[0015]進一步，在步驟(6)的同步測試與記錄中，金屬鍍膜納米通道能產生表面等離子激元共振；通過調節所述金屬鍍膜納米通道的幾何形貌(如尺寸、形狀)、鍍膜厚度、鍍膜種類以及通道及周圍基片的形貌，能實現對所述金屬鍍膜納米通道特有的散射信號強度、光譜、偏振狀態的調控。
[0016]進一步，在步驟(6)的同步測試與記錄中，金屬鍍膜納米通道能產生離子電流信號；通過調節所述金屬鍍膜納米通道的幾何形貌(如尺寸、形狀)、鍍膜厚度、鍍膜種類，能實現對所述金屬鍍膜納米通道特有的離子電流信號基線的調控。
[0017]本發明基于暗場成像的固態納米通道的光電同步傳感方法的積極效果是:
(I)利用金屬鍍膜納米通道邊沿金屬在可見光激發下產生的表面等離子激元共振，使納米通道自身產生可被探測、可被調節、有特征的散射光信號，達到無需染料基團、無需標記就能讀取單個納米通道光信號的目的。
[0018](2)通過光電同步傳感的方法，在不引入染料基團、染料分子并且在無需標記的情況下能實現對單個納米尺度待測物穿孔(納米通道)過程的實時動態監測。
[0019](3)利用同步可對照的數據采集方法，實現對待測物體積、帶電情況、光學性質、化學結構等動態信息的采集，能從多個維度觀測單個待測物在運動過程中各類性質變化的情況。
[0020](4)將光學探測與電流檢測方法相結合，實現了大規模多通道信號的同步獲取，加速了納米通道技術的檢測速率，擴大了其應用領域。
【附圖說明】
[0021]圖1為本發明基于暗場成像的固態納米通道的光電同步傳感方法的流程框圖。
[0022]圖2為實施例1涂敷有金屬納米涂層的半導體基片薄膜的結構示意圖。
[0023]圖3為金屬覆膜納米通道芯片的結構示意圖。
[0024]圖4為光電檢測微池的結構示意圖。
[0025]圖5為暗場成像、光譜及光路強度監測的原理框圖。
[0026]圖6為圖5中第二相機的替代形式。
[0027]圖中的標號分別為:
1、金層；2、鈦層；3、氮化娃薄膜；
4、方窗；5、基片；6、通孔；
7、上蓋玻片；8、上池體；9、金屬覆膜納米通道芯片；
10、下池體；11、下蓋玻片；12、注放液管。
【具體實施方式】
[0028]以下結合附圖繼續介紹本發明基于暗場成像的固態納米通道的光電同步傳感方法的【具體實施方式】。需要說明的是，本發明的實施不限于以下的實施方式。<