一種快速檢測腎衰的三聯(lián)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于腎臟衰竭的早期預(yù)警、治療過 程和愈后監(jiān)控的=聯(lián)試劑盒，并進(jìn)一步公開了其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[000引急性腎損傷（AKI)是急性腎衰竭的連續(xù)性過程，AKI廣泛發(fā)生于糖尿病人、交通事 故傷害、重癥患者、大手術(shù)后患者，它按FIFLE標(biāo)準(zhǔn)分為風(fēng)險(xiǎn)、損傷、衰竭、腎功能喪失和終 末期腎病。急性腎損傷盡早診斷有助于對病人實(shí)施保護(hù)性治療，降低死亡率。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，臨床急性腎損傷診斷的生物標(biāo)志物是肌酢、尿素氮和尿量。肌酢是 骨骼肌中肌酸到磯酸肌酸，并在肝臟中轉(zhuǎn)化形成，并從腎小球?yàn)V過，其中少部分肌酢分泌入 尿，肌酢不能在腎小管重吸收或在腎臟代謝。血清肌酢作為急性腎損傷的標(biāo)志物的局限性 主要體現(xiàn)在；第一，肌酢產(chǎn)生因年齡、性別、飲食、肌肉情況、藥物及激烈運(yùn)動差異明顯，影響 了其診斷的準(zhǔn)確性；第二，肌酢分泌約占肌酢清除的10-40%，該將導(dǎo)致GFR的假性降低； 第S，血清肌酢試驗(yàn)精確性可因假象而降低；第四，肌酢出現(xiàn)異常時(shí)，GFR減少大都已超過 50%，并且需超過24小時(shí)才能檢測到血肌酢濃度。該些因素都會導(dǎo)致W肌酢作為急性腎損 傷的早期診斷標(biāo)志存在嚴(yán)重的局限性。
[0004] 尿素氮是水溶性的、低分子量的蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物。它的血濃度與GFR相反，部分因 素可影響它的產(chǎn)生和清除，該就限制了它評估GFR的可靠性。尿素氮的產(chǎn)生是多變的，它的 值可因循環(huán)血量、蛋白質(zhì)攝入、胃腸道出血等的變化而改變。腎臟尿素氮清除率也是變化 的；40-50%濾過的尿素氮在腎小管重吸收。所從尿素氮是不太適合評估GFR的，因?yàn)闈舛?升高需時(shí)間累積，不能及時(shí)反映GFR變化而耽擱診斷。
[0005] 更重要的是，由于很多AKI病人并沒有出現(xiàn)少尿，或者很多手術(shù)及ICU病人僅出現(xiàn) 了少尿，但并沒有出現(xiàn)急性腎損傷。因此，該些依賴傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物（肌酢，尿素氮，尿 量）來診斷AKI，多在損傷后幾小時(shí)才出現(xiàn)異常（肌酢，尿素氮），同時(shí)也缺乏特異性（尿 量），該些均會造成治療上耽擱，該也是臨床AKI治療效果不佳的重要原因之一。
[0006] 鑒于現(xiàn)有臨床上面臨的該些問題，新的早期急性腎損傷的生物標(biāo)志物已被逐步 開發(fā)出來。包括人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL)，半脫氨酸蛋白酶抑制劑 C(切C)，C反應(yīng)蛋白（CRP)，均已在AKI的診斷中發(fā)揮重要作用。
[0007] 中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)性脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL)是一種小分子量分泌型蛋白，由 Kjeldse化等人于1993年發(fā)現(xiàn)，是Lipocalin家族的新成員。生理?xiàng)l件下，NCAL少量合成 于骨髓中性粒細(xì)胞和腎小管等多個系統(tǒng)的上皮細(xì)胞，炎癥反應(yīng)和惡性腫瘤可誘使其在多組 織（如子宮、前列腺、唾液腺、肺、腎、氣道及消化道上皮等）中大量生成，幾個小時(shí)內(nèi)就可W 達(dá)到峰值，產(chǎn)生速度明顯快于其它相關(guān)生物標(biāo)記物。NGAL在急性腎小管損傷早期就已經(jīng)表 達(dá)，反映腎小管功能素亂，它濃度的升高提示腎小管損傷發(fā)生，而傳統(tǒng)指標(biāo)血肌酢升高則需 24小時(shí)W上。NGAL也是目前新型AKI診斷的首選指標(biāo)物。
[000引脫抑素C也稱半脫氨酸蛋白酶抑制劑C，切sC分子量為13KD，由120個氨基酸組 成，它編碼的基因是存在于機(jī)體所有有核細(xì)胞中的一種管家基因，因此人體幾乎所有的有 核細(xì)胞均可W產(chǎn)生切sC，且產(chǎn)生率恒定。生理?xiàng)l件下，切sC抑制內(nèi)源性半脫氨酸蛋白酶的 活性，切sC是一種低分子量蛋白質(zhì)，能經(jīng)腎小球?yàn)V過而被清除，在腎小球近曲小管重吸收并 被完全分解代謝，且腎臟是唯一清除切sC的器官，機(jī)體產(chǎn)生切sC的速率也相當(dāng)恒定。研究 證明，切sC是一種比較接近理想的反映腎小球?yàn)V過功能的內(nèi)源性標(biāo)志物。當(dāng)腎小球出現(xiàn)輕 微損傷時(shí)，切sC在血液中的濃度會迅速升高。切sC能靈敏的檢測到腎小球?yàn)V過功能的改 變，對腎功能早期損壞進(jìn)行診斷。
[0009] C反應(yīng)蛋白（C-reactiveprotein,CRP)是由肝細(xì)胞所合成，具有激活補(bǔ)體和促進(jìn) 粒細(xì)胞及吞瞻細(xì)胞的吞瞻作用。CRP是第一個被認(rèn)為是急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，正常情況下含量 極微量，在AKI、急性創(chuàng)傷和感染時(shí)其血濃度急劇升高。CRP濃度升高可反映體內(nèi)炎癥處于 急性活動期，如急性炎癥、組織損傷和AKI等疾病，說明有進(jìn)行性組織壞死或并發(fā)感染的存 在，CRP是臨床上AKI最常用的急性時(shí)相反應(yīng)指標(biāo)。
[0010] 現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)開發(fā)出了諸如WNGAL、切sC或者CRP為單一指標(biāo)的膠體金試紙條 或免疫巧光試紙條，意在通過檢測NGAL、切sC或者CRP的指標(biāo)變化對腎衰的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)行 監(jiān)測。但是臨床實(shí)踐證明，上述單一指標(biāo)的檢測試劑，由于臨床各種難于預(yù)測的情況而存在 著準(zhǔn)確性欠佳的問題，依然難于保證腎衰的快速及準(zhǔn)確的檢測，不能全面地、特異性地預(yù)警 急性腎衰的發(fā)生、發(fā)展過程。而且目前WNGAL、切sC、CRP為目標(biāo)物產(chǎn)品均W不同形式在臨 床上應(yīng)用，制作原理及操作程序各不相同，兼容性比較差，很難在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)、快速地檢 測出=者的結(jié)果，極大地影響了對急性腎衰患者的準(zhǔn)確診斷，從而造成很多病人因延誤救 治而病情惡化或?qū)е滤劳觥?br>[0011] 因此，目前臨床上急需開發(fā)一種可全面、快速、簡便的診斷、監(jiān)測腎衰的發(fā)生、發(fā)展 的試劑，可隨時(shí)監(jiān)控發(fā)生腎衰的風(fēng)險(xiǎn)，避免因病情的延誤而發(fā)生嚴(yán)重的后果。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0012] 為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于現(xiàn)有技術(shù)中用于檢測腎衰竭的試劑由于檢 測指標(biāo)單一而導(dǎo)致檢測結(jié)果不穩(wěn)定的問題，進(jìn)而提供一種可全面、快速、簡便的診斷、監(jiān)測 腎衰的發(fā)生、發(fā)展的試劑盒，并進(jìn)一步公開其制備方法及應(yīng)用。
[0013] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所述的快速檢測腎衰的S聯(lián)試劑卡，所述試劑卡W 血清半脫氨酸蛋白酶抑制劑（切sC)、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)性脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NAGL)及C反 應(yīng)蛋白（CR巧為檢測標(biāo)志物。
[0014] 進(jìn)一步的，所述試劑卡包括樣品區(qū)、抗體結(jié)合區(qū)，檢測控制區(qū)及吸水區(qū)；所述抗體 結(jié)合區(qū)含有切sC、NGAL、CRP的特異性抗體，所述檢測控制區(qū)含有分別與切sC、NGAL、CRP相 對應(yīng)的單克隆抗體、多克隆抗體，或相應(yīng)的抗原。
[0015] 更優(yōu)的，所述試劑卡包括：
[0016] 底板W及沿所述底板的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊、結(jié)合墊、抗 體承載膜和吸樣墊，且所述樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜和吸樣墊之間，依次與且僅與相鄰 部位相接觸且部分重疊；
[0017] 所述抗體承載膜粘附于所述底板的中間部位，其上順次設(shè)置有第一檢測線、第二 檢測線、第=檢測線和質(zhì)控線，所述第一檢測線靠近所述結(jié)合墊，所述質(zhì)控線靠近所述吸樣 墊；
[001引所述結(jié)合墊上噴涂有切sC、NGAL、CRPS種特異性抗體；
[0019] 所述第一檢測線、第二檢測線、第S檢測線分別彼此獨(dú)立的由與切sC、NGAL、CRP 相對應(yīng)的單克隆抗體、多克隆抗體或相應(yīng)的抗原涂層形成，且彼此不同。
[0020] 所述第一檢測線、第二檢測線及第=檢測線相間隔平行設(shè)置，或者彼此不重疊的 并列設(shè)置。
[0021] 所述質(zhì)控線由抗鼠IgG抗體涂層形成。
[0022] 制備所述結(jié)合墊的載體包括膠體金納米顆粒、巧光膠乳、磁珠、量子點(diǎn)或稀±元 素。
[0023] 所述結(jié)合墊為膠體金墊，由標(biāo)記有切sC、NAGL、CRP抗體的膠體金納米顆粒噴涂于 玻璃纖維素膜或無紡布上制成；或者，
[0024] 所述結(jié)合墊為免疫巧光墊，由免疫巧光物質(zhì)標(biāo)記的乳膠微球噴涂于玻璃纖維素膜 或無紡布上制成。
[0025] 所述結(jié)合墊上，所述切sC、NGAL、CRPS種特異性抗體分別與不同顏色的量子點(diǎn)相 結(jié)合。
[0026] 本發(fā)明還公開了一種制備上述快速檢測腎衰的=聯(lián)試劑卡的方法，包括如下步 驟：
[0027] (1)結(jié)合墊的制備；按照現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)方法將標(biāo)記有切sC、NAGL、CRP特異性抗體 的載體顆粒噴涂于玻璃纖維素膜或無紡布上，烘干備用；
[002引 似抗體承載膜的制備；將與切sC、NGAL、CRP相對應(yīng)的單克隆抗體、多克隆抗體或 相應(yīng)的抗原稀釋，劃線噴涂于抗體承載膜，形成所述第一檢測線、第二檢測線、第=檢測線， 并將抗鼠IgG抗體稀釋并劃線噴涂形成所述質(zhì)控線，烘干備用；
[0029] (3)組裝；在底板上順次粘結(jié)樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜和吸樣墊，各部分依次 與且僅與相鄰